Sec1/Munc18蛋白的研究进展

大多数细胞包含许多种转运到不同目的地的囊泡。尽管存在许多特定的转运途径,根本的分子原则非常相似并在进化中保守。有充足的证据表明,膜融合除需要SNARE蛋白家族的参与外,也需要Secl/Munc18(SM)蛋白;但是与SNARE蛋白功能的一致清楚相反,不同的实验系统得到的不同研究数据,使人们对于不同的SM蛋白的确切作用、作用位点和它们与SNARE蛋白的作用方式持不同观点。不同的SM蛋白与SNARE蛋白存在三种不同的作用模式。最近的研究确定,Munc18-1直接促进融合,并且它可能以所有三种模式与SNARE蛋白相互作用。本文综述了该领域的最新研究进展。

GST-hMunc18-1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建hMunc18-1的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:从人HEK293细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hMunc18-1基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-6p-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-6p-1-hMunc18-1。异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在E.coli BL21大肠杆菌中诱导GST-hMunc18-1融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western Blot鉴定结果。结果:hMunc18-1编码序列克隆至pGEX-6p-1载体中,双酶切鉴定片段大小为1785 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为67 000 Da,成功纯化出GST及GST-hMunc18-1蛋白,Western Blot检测到蛋白表达。结论:成功地构建了hMunc18-1基因原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化Munc18-1及研究其结构与功能奠定了基础。

人类Munc18-1重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建人类Munc18-1(hMunc18-1)真核表达质粒pEGFP-hMunc18-1并检测其融合蛋白GFPhMunc18-1在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库中的cDNA为模板,聚合酶链反应PCR扩增hMunc18-1全长编码基因,亚克隆至绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中。将构建的重组质粒pEGFPhMunc18-1送到Invitrogen公司进行基因测序,根据NCBI数据库中的hMunc18-1基因序列判断所得重组质粒的基因序列是否正确。将测序正确的质粒pEGFP-hMunc18-1转染到非洲绿猴肾细胞COS-7细胞中,提取细胞蛋白以Western blot法检测融合蛋白GFP-hMunc18-1表达,利用共聚焦激光扫描显微镜观察其在非洲绿猴肾细胞COS-7内的定位。结果 hMunc18-1全长基因序列被成功克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,经酶切后鉴定其片段大小为1785bp。Western blot检测到融合蛋白GFP-hMunc18-1相对分子质量约为94 000,主要分布在细胞质,尤其是细胞膜附近。结论成功构建了hMunc18-1全长基因真核表达质粒pEGFPhMunc18-1,其融合蛋白GFP-hMunc18-1主要定位于COS-7细胞质内,尤其是细胞膜附近。

突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的定位表达

目的研究突触囊泡融合蛋白Munc18-1在小鼠耳蜗内毛细胞的表达及定位。方法应用激光共聚焦成像技术,通过免疫荧光单标法检测Munc18-1蛋白在小鼠耳蜗内毛细胞中的表达,免疫荧光双标法检测其与带状突触蛋白Ct BP2的定位关系。结果通过激光共聚焦成像技术检测发现,免疫荧光单标染色显示内毛细胞胞质中有高浓度的Munc18-1蛋白表达,免疫荧光双标染色结果显示Munc18-1蛋白聚集在Ct BP2蛋白附近。结论 Munc18-1蛋白在耳蜗内毛细胞中有表达,聚集在突触蛋白Ct BP2周围,可能与维持突触囊泡融合、胞吐功能紧密相关。

基于SM蛋白的CHO细胞分泌工程化改造和抗体表达的研究

目的通过构建基于SM基因的分泌工程化改造的CHO-AV-SM细胞株,探讨在悬浮培养条件下,过表达转运蛋白SM基因对分泌蛋白表达的影响。方法首先从人HEK293FT细胞中克隆出sly1和munc18c基因,然后构建含有SM基因的真核表达载体pBSM;随后将pBSM质粒稳定转染入CHO-AV细胞并鉴定,获得了基于SM基因的分泌工程化改造的CHO-AV-SM细胞株;在此基础上对CHO-AV-SM细胞株进行悬浮培养适应,并测定了CHO-AV和CHO-AV-SM细胞株的生长和蛋白表达参数。结果过表达转运蛋白SM基因,CHO-AV-SM细胞株的抗体表达量较CHO-AV抗体表达量提高约75%,且测得第6天细胞数达到最大值,此时CHO-AV的表达量约为45.4μg/ml,CHO-AV-SM的表达量为79.5μg/ml。结论通过构建全抗稳定表达细胞,在细胞中过表达SM基因,并悬浮培养适应,建立了悬浮培养条件下基于转运蛋白过表达的分泌工程改造方法,为转运蛋白改造CHO细胞,提升全抗表达能力提供了有力支持。

参与膜泡运输的蛋白家族及其运行机制的研究进展

细胞的生长和分化最终体现在蛋白质的差异上 ,蛋白质在胞浆中的核糖体合成后 ,便被运送到特定的细胞器、细胞膜或者分泌到细胞外。细胞在其生长、发育、衰老、死亡等过程中 ,都伴随着特定蛋白的定位及运输。膜泡运输对于完成细胞器及细胞膜之间的蛋白运输功能至关重要 ,目前已发现了参与这一过程的 4个蛋白家族 ,并对其基本的运行机制有了一定的了解。

Syntaxin-1蛋白的多重功能(英文)

Syntaxin-1是特异性地分布在神经细胞突触前质膜上的蛋白。它早期被作为分子量为35 kD的synaptotagmin-1结合蛋白,但很快就被认识到是细胞质膜融合的关键蛋白。Syntaxin-1通过与SNAP25和Synaptobrevin/VAMP蛋白聚合,进而形成被认为是神经突触囊泡融合必要因子的SNARE核心复合体。作为一个多结构域的蛋白,syntaxin-1与多个突触蛋白相互作用,其作用远超出了仅作为SNARE核心复合体中一个蛋白质成员的作用。本文着重介绍了有关syntaxin-1与其它SNARE组份蛋白、munc18蛋白和钙离子通道的相互作用及其功能的最新研究进展。全面揭示syntaxin-1作为SNARE核心复合体成员的功能以及超越这一功能的作用,还有待于对其结构以及与其它突触蛋白相互作用特性的进一步深刻理解。