Sec62/Sec63复合物对乙型脑炎病毒在HEK-293细胞中复制影响的研究

Sec62/Sec63是位于内质网膜上的跨膜蛋白复合物,辅助新合成的前体蛋白或新生多肽链转运至内质网,进行后期的折叠加工。为研究Sec62/Sec63复合物对乙型脑炎病毒(JEV)复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建SEC62、SEC63基因敲除的HEK-293细胞系,经测序鉴定以及western blot检测,获得两个基因敲除细胞系,分别命名为SEC62 KO HEK-293细胞和SEC63 KO HEK-293细胞。分别以MOI为1、0.05的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,利用间接免疫荧光试验检测Sec62/Sec63复合物对JEV复制的影响。结果显示,不同剂量JEV感染SEC62 KO HEK-293细胞与SEC63 KO HEK-293细胞中荧光信号阳性细胞均少于HEK-293细胞对照组;以MOI为1的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,经western blot检测,结果显示于感染后12 h、24 h和48 h,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞中均未检测出JEV E蛋白条带,而对照HEK-293细胞中JEV E蛋白的表达量逐渐增加。以MOI为1的JEV感染上述3种细胞后检测细胞培养液中病毒滴度,结果显示JEV感染12 h后SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞与HEK-293细胞病毒滴度无差异(p>0.05),而感染后24 h与48 h时,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p<0.01)。以MOI为1、0.5、0.05的JEV感染上述3种细胞后检测48 h后细胞培养液中病毒滴度,结果显示SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p<0.001)。以上结果表明,SEC62、SEC63基因敲除后均抑制了JEV的复制,也表明Sec62、Sec63是影响JEV在细胞内复制的重要宿主因子。本研究为进一步探究Sec62、Sec63等宿主因子对JEV复制的影响机制提供了参考依据。

Sec62对结直肠癌细胞的增殖作用及其潜在机制

目的探索Sec62对结直肠癌细胞的增殖作用及其潜在机制。方法应用Western blotting技术在结直肠癌细胞和永生化正常结肠上皮细胞中检测Sec62蛋白的表达。依据结直肠癌细胞中Sec62蛋白的表达情况,选取两株结直肠癌细胞分别构建Sec62过表达稳定转染细胞及其对照(NC:过表达阴性对照组,以过表达组阴性对照病毒转染细胞;OE:过表达组,以过表达慢病毒转染细胞)和Sec62敲减稳定转染细胞及其对照(shNC:敲减阴性对照组,以敲减组阴性对照病毒转染细胞;KD-1:敲减组1,以敲减慢病毒1转染细胞;KD-2:敲减组2,以敲减慢病毒2转染细胞)。采用CCK-8、平板克隆形成等增殖相关体外实验检测稳定转染组及其对照组细胞的增殖能力。构建裸鼠皮下移植瘤模型评估Sec62对结直肠癌细胞体内增殖能力的影响,将24只雄性BALB/c裸鼠随机分为NC、OE、shNC、KD-14组,每组6只,将稳定转染组及其对照组细胞分别接种于裸鼠腹股沟处,5周后处死裸鼠,观察各组裸鼠皮下成瘤形成情况。采用流式细胞术检测稳定转染组及其对照组细胞周期变化。利用Western blotting检测稳定转染组及其对照组细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4和PCNA的表达。结果Western blotting发现Sec62在结直肠癌细胞中的表达显著高于正常结肠上皮细胞(P<0.01)。CCK-8和平板克隆实验结果均表明与NC细胞相比,OE细胞的增殖能力增强(P<0.05),而与shNC相比,KD-1和KD-2细胞的增殖能力明显降低(P<0.05)。裸鼠皮下移植瘤模型显示Sec62过表达细胞种植后形成的皮下肿瘤质量显著高于NC(P<0.01),而Sec62敲减(KD-1)细胞种植后裸鼠皮下成瘤的质量低于shNC(P<0.01)。流式细胞术检测细胞周期的结果显示,Sec62表达升高后细胞周期进程加快,而Sec62表达被抑制后细胞周期停滞。Western blotting结果表明,与NC细胞相比,OE细胞中Cyclin D1、CDK4和PCNA蛋白表达水平升高,而与shNC细胞相比,KD-1和KD-2细胞中Cyclin D1、CDK4和PCNA蛋白表达水平降低。结论Sec62可通过调控结直肠癌细胞的细胞周期影响结直肠癌的体内外增殖,从而在结直肠癌细胞的恶性增殖中发挥促癌作用。

内质网整合膜蛋白SEC62研究进展

内质网是真核细胞内蛋白质加工的必要场所,经过加工的蛋白质才能在内质网中驻留或转运至高尔基体。如果内质网中蛋白质未能正确折叠与运输,内质网内就会累积大量蛋白质,造成内质网应激。SEC62在维护蛋白质稳态中扮演重要作用,它是由399个氨基酸残基组成的内质网跨膜蛋白,能够参与真核细胞中分泌蛋白及膜结合蛋白的翻译后易位,也能够与SEC61通道结合调控内质网中的钙稳态,并在内质网应激恢复过程中被显著激活来维持内质网体积和大小。本文系统地阐述了SEC62的功能、调节的信号通路,及其在包括病毒复制和多种癌症等疾病中的作用及意义,基于这些研究结果可能将SEC62作为抗病毒治疗及肿瘤精确诊断、治疗的新靶点,为新药物的开发提供新思路。

三石猫复方对裸鼠肝癌切除术后肿瘤复发的影响及机制

目的观察三石猫复方对裸鼠肝原位移植瘤切除术后肿瘤复发的影响,并初步探讨其机制。方法建立人肝癌Huh7细胞原位移植瘤裸鼠模型,随机分为治疗组和对照组,每组6只。手术切除原位瘤3 d后,分别使用三石猫复方[18g/(kg·d)]及生理盐水灌胃14d。观察肝脏肿瘤复发率,采用Western Blot检测复发瘤中转运蛋白Sec62表达;体外建立Huh7过表达Sec62稳转株,三石猫复方干预后,观察Huh7细胞增殖和侵袭迁移情况。结果与对照组比较,治疗组肿瘤术后复发率明显降低[33.3%(2/6)vs.100%(6/6),P<0.05],复发肿瘤组织中Sec62蛋白表达亦降低(P<0.05)。体外实验显示,三石猫复方处理浓度≥1.0mg/mL时,细胞增殖抑制明显(P<0.01)。三石猫复方处理浓度在0.2、0.5mg/mL时,可抑制肝癌细胞Huh7侵袭迁移,将Huh7细胞中的Sec62过表达后,这种抑制作用明显减弱。结论三石猫复方可以抑制人肝癌Huh7细胞原位移植瘤手术切除后复发肿瘤的生长,其机制可能与通过降低Sec62表达抑制细胞的侵袭迁移有关。