大豆成熟种子萌发叶片体细胞胚的高频诱导和遗传转化

目的虽然大豆遗传转化取得了较大进展,但其转化效率仍然偏低。因此,有必要建立一个更加简单和高效的大豆转化系统。本研究的目的是以大豆成熟种子萌发产生的叶片(MSDL)为靶外植体,高频诱导和转化大豆体细胞胚(somatic embryos,SEs)。方法萌发7 d的大豆幼苗上摘取叶片,并将其切成1.2 cm×1.2 cm的外植体。将叶片外植体置于胚胎诱导培养基(EIM)上诱导体细胞胚发生。将叶片外植体浸入携带p CAMBIA1301植物表达载体的农杆菌EHA105菌液进行遗传转化。结果MSDL(包括初生叶和次生叶)均能被诱导产生SEs。大多数SE发生在叶片切口处。所试的不同基因型均能诱导SEs。SEs的最高诱导率为95.0%。β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色结果表明,平均转化效率达到75.4%。DNA印迹(Southern blot)结果表明,目的基因稳定整合在大豆基因组中,拷贝数为1~3个。结论本研究建立了以大豆MSDL为靶组织的体细胞胚高频诱导和遗传转化。该系统有望在大豆基因组编辑技术的开发上得到应用。

Simultaneous genetic transformation and genome editing of mixed lines in soybean(Glycine max)and maize(Zea mays)

Robust genome editing technologies are becoming part of the crop breeding toolbox.Currently,genome editing is usually conducted either at a single locus,or multiple loci,in a variety at one time.Massively parallel genomics platforms,multifaceted genome editing capabilities,and flexible transformation systems enable targeted variation at nearly any locus,across the spectrum of genotypes within a species.We demonstrate here the simultaneous transformation and editing of many genotypes,by targeting mixed seed embryo explants with genome editing machinery,followed by re-identification through genotyping after plant regeneration.Transformation and Editing of Mixed Lines(TREDMIL)produced transformed individuals representing 101 of 104(97%)mixed elite genotypes in soybean;and 22 of 40(55%)and 9 of 36(25%)mixed maize female and male elite inbred genotypes,respectively.Characterization of edited genotypes for the regenerated individuals identified over 800 distinct edits at the Determinate1(Dt1)locus in samples from 101 soybean genotypes and 95 distinct Brown midrib3(Bm3)edits in samples from 17 maize genotypes.These results illustrate how TREDMIL can help accelerate the development and deployment of customized crop varieties for future precision breeding.

农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化影响因子的研究

用大豆体细胞胚为外植体,以抗性体细胞胚筛选率为转化率的指标,研究了农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化系统的几种影响因子。结果表明,用球形期的体细胞胚受伤处理作为转基因的受体、预培养1.5天有利于转化;筛选不同的代数,转化率在3个月以前明显下降,而在3个月以后则基本稳定在8%左右。

影响大豆体细胞胚萌发率的因素

研究了影响大豆体细胞胚萌发率的几种因素。结果表明 ,基因型间、培养基间大豆体细胞胚的萌发率差异达显著水平 ;同一大豆品种 。

影响大豆体细胞胚诱导因素的研究

体细胞胚的诱导是大豆体外再生的关键。基因型、诱导光周期、外植体的荚位、蔗糖浓度等因素 ,可导致诱导频率及正常胚比例不同 ,影响植株再生。本研究选用黑龙江省主栽大豆基因型的未成熟子叶 ,在含高浓度生长素的MSB培养基上诱导体细胞胚产生。合丰 2 5和东农 781 9为优选基因型 ;生育前期下部荚位大小为 2～ 4mm未成熟子叶体细胞胚发生效果最好 ;四种光周期下体细胞胚诱导频率相近 ,但连续弱光下正常胚比例高 ;NAA诱导优于 2 - 4,D ;1 0mg/lNAA与1 .

大豆体细胞胚的成熟处理及植株再生

选用体细胞胚高频发生的黑龙江省主栽大豆品种 (东农 7819)的未成熟子叶 ,在含高浓度的生长素 MSB培养基上诱导体细胞胚的产生。体细胞胚分别置于 M3、M10、MC三种成熟培养基上或单纯置于灭菌过的培养皿进行干化处理。成熟处理为大豆体细胞胚萌发所必需。单纯干化处理不利于体细胞胚存活 ,而在高渗成熟培养基 MC或 M10成熟处理过的体细胞胚在 MSG(1/2 MSB+ GA)萌发培养基上的萌发率明显高于 M3。成熟处理后 ,形态正常体细胞胚的萌发率达90 % ,明显高于形态不正常胚 4 %的萌发率。对成熟处理过的体细胞胚的组织学研究表明 ,形态学上苗端未分化是形态不正常胚不能形成完整植株的原因之一。

农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化系统的优化研究

以大豆球形期体细胞胚为外植体 ,以抗性体细胞胚筛选率为指标 ,对影响农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化频率的因子进行了优化。结果表明 ,菌液浓度以OD6 0 0 =0 .5 - 0 .7、AS浓度为5 0 - 10 0 μmol/L、侵染时间 10分钟、共培养时间 2 - 3天 ,有利于提高转化率。

大豆体细胞胚再生植株的研究

以球形期大豆体细胞胚为材料,对其进行继代增殖、萌发及再生植株的研究。结果表明,大豆体细胞胚每隔15-20天分割成3mm左右的小块在MS培养基附加10-20 mg/L 2,4-D的固体培养基以及弱光条件下,可以继续增殖,继代增殖能力强,扩繁系数为3n(n为继代培养次数);大豆体细胞胚性组织先在含有活性碳的培养基上培养,能提高其萌发率以及正常胚率,1个月以后转移到无活性碳的培养基,又能提高其再生速度以及再生率。

Box-Behnken响应面设计优化微波辅助提取大豆胚芽黄酮的工艺

以大豆胚芽为原料,以乙醇为浸提溶剂,通过微波辅助提取及Box-Behnken响应面设计优化大豆胚芽黄酮的提取工艺,得到最优工艺参数为:提取时间162s,功率687W,料液比1∶18,乙醇浓度68%。经回归分析表明:回归方程的R2=94%,R2Adj=87.99%,预测值为16.33mg/g。经验证,在最优提取工艺条件下,大豆胚芽总黄酮得率为16.16mg/g,回归模型的预测值与实测值的相对误差<1%。

大豆幼胚子叶胚性悬浮细胞系的建立与次生胚诱导

本研究选用黑龙江省 5个大豆品种的幼胚子叶 ,建立了胚性悬浮培养体系 ,并由悬浮体系增殖产生次生胚。系统探讨了培养基组成和浓度对体细胞胚诱导和悬浮培养物生长的影响 ,以及悬浮体系继代时间与胚成熟率和再生率的关系。结果表明 ,高效体细胞胚诱导培养基为 :MSB +4 0mg/L 2 ,4 -D + 6 %蔗糖。高效球型胚增殖培养基为 10mg/L2 ,4 -D + 1/2MS氮源 + 5mM谷氨酰胺 + 5mM天门冬酰胺。培养 8周后的次生胚成熟率和再生率显著提高 ,到第 12周分别达6 3%和 35 % 。

用基因枪法将Bt基因转入大豆的研究

以大豆品种合丰25的体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,经体细胞胚萌发、生根及壮苗培养和卡那霉素选择培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中。

适于体细胞胚发生的大豆基因型筛选

以41个北方春大豆品种为材料,研究了不同基因型大豆体细胞胚的诱导率。结果表明:不同基因型大豆的体细胞胚发生率有显著差异,在供试品种中,垦丰23的体细胞胚胎发生率(99.7%)最高,合丰55等9个基因型体细胞胚诱导率为70%～90%;登科4等5个基因型无体细胞胚发生。垦丰23体细胞胚呈葡萄状、颜色鲜绿、每个未成熟子叶上体细胞胚的数量较多、无畸形胚、且每个体细胞胚是独立存在的,其他诱导率较高的基因型每个未成熟子叶分化体细胞胚的数目较少,且部分基因型含有畸形胚。

大豆品种合丰25体细胞胚发生条件的优化

为优化大豆体细胞胚再生植株的条件,提高大豆遗传转化的效率,本研究选用大豆品种合丰25为试验材料,针对影响体细胞胚诱导的3个关键因素pH值、2,4-D浓度及光照条件进行体细胞胚发生频率的研究。结果表明:pH值、2,4-D浓度、光照条件这3种因素的不同处理对体细胞胚的诱导影响显著,其幼胚的发生频率最高为70.70%、最低为3.70%。当pH值为7.0、2,4-D浓度为20mg/L,黑暗培养最有利于合丰25体细胞胚的诱导,其胚的发生频率为70.70%,明显高于其他处理。

大豆幼胚培养直接成苗影响因素研究

为建立大豆幼胚培养直接成苗方法,分别研究了大豆幼胚胚龄、幼胚预处理方法、培养基及大豆品种对大豆幼胚培养直接成苗的影响。结果表明:15 d胚龄的幼胚平均萌发率为23%,20 d及以上胚龄的幼胚萌发率高于70%,20 d胚龄的幼胚虽能萌发,但芽和根的正常生长较为困难。在低温(4℃)、高温(37℃)和GA(100 mmol.L-1)预处理幼胚2 d再进行培养条件下,高温预处理平均成苗率达75%;而低温和GA预处理的成苗率只有4%。所试几种培养基对幼胚成苗效果没有显著影响。不同品种中,极早熟品种日本晴和台农292成苗率分别为74%和72%,早熟品种台湾75和苏早1号成苗率均为64%,夏大豆临豆8号成苗率(54%)最低。

基因枪法将GmDREB基因导入大豆的研究

测定大豆体细胞胚对PPT的基础抗性,用基因枪法将pRdGM-bar质粒转化大豆体细胞胚,得到抗性体细胞胚和抗性植株,经PCR、PCRsouthern检测,证明GmDREB基因转入到大豆中。

基因枪法对大豆进行CpTI基因的遗传转化

以大豆品种合丰25的球形期体细胞胚为受体,以CpTI基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,同时以抗性体细胞胚筛选率作为转化率的指标,对影响基因枪转化的几个参数进行了优化研究。结果表明,氯化钙浓度2.5 mol/L、氦气压力1 100 Psi、轰击次数为2次,有利于提高转化率;经卡那霉素筛选得到抗性植株,经PCR分析鉴定有2株为阳性,初步证明外源基因CpTI已转到大豆基因组内。

大豆体细胞胚的诱导及对草甘膦耐性的研究

以大豆未成熟子叶为外植体,研究合丰25、吉林35、吉育91对未成熟子叶体细胞胚诱导率的影响,并探讨3种基因型大豆未成熟子叶对草甘膦的耐性。结果表明:3种基因型的愈伤组织诱导率均为100%,体细胞胚诱导率为53.95%～72.12%,平均胚数吉育91高于其它2种基因型。3种基因型的体细胞胚诱导率在草甘膦浓度间存在差异,在大豆以未成熟子叶为受体转基因时,诱导体细胞胚胎发生的草甘膦筛选浓度为2.5～5.0 mg.L-1。

大豆胚芽索氏提取法制油工艺条件初步研究

以石油醚(60～90℃)作为脱脂溶剂对大豆胚芽进行索氏提取,采用L9(33)正交表进行分析,以大豆胚芽出油率为指标,确定大豆胚芽制油的最佳工艺参数为:粒度30目,料液比1∶13,回流时间5h。

大豆胚芽油提取工艺的研究

以大豆胚芽出油率为指标,石油醚为脱脂溶剂,通过单因素和正交试验对大豆胚芽索氏提取工艺进行了研究。结果表明:大豆胚芽制油的最佳提取工艺为:粒度30目,料液比1:13,回流时间5h。在此条件下,大豆胚芽出油率为10.50%。

大豆籽粒异黄酮含量的遗传效应分析

以朱军提出的混合模型方法,采用亲本、F1、F23个世代,分析大豆异黄酮含量的胚效应、细胞质效应和母体效应。结果表明,大豆种子中异黄酮含量同时受到胚遗传效应和母体遗传效应的控制,并且母体效应的作用要高于胚遗传效应。胚显性方差、母体加性方差和母体显性方差均达到显著水平。在胚和母体两套遗传体系中,加性效应方差占总遗传方差的18.8%,胚显性方差与母体显性方差之和占总遗传方差的81.2%。胚广义遗传率为17.3%,母体效应的广义遗传率为33.6%。异黄酮含量与株高和单株产量的正向基因型协方差、异黄酮含量与单株节数的负向基因型协方差达到显著水平。异黄酮含量与株高和单株产量间主要以母体显性协方差为主,异黄酮含量与单株节数间主要以胚加性协方差为主。