帕利亚姆血清群病毒qRT-PCR检测方法的建立与应用

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)具有多种血清型,可引起感染的妊娠家畜出现生产异常,在我国呈广泛流行的趋势,但目前尚无该病毒的高通量快速检测技术。本研究旨在建立PALV的高通量逆转录实时荧光定量(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测方法用于临床样本中病毒的检测。采用一步法RT-PCR对我国流行的PALV代表毒株的基因节段7(Seg-7)进行全长序列测定,根据Seg-7高度保守的区域合成特异性PCR引物与TaqMan探针,建立PALV的qRT-PCR检测方法;以体外转录PALV的Seg-7 ssRNA为模板,分析qRT-PCR检测方法的特异性、敏感性与重复性;以我国不同血清型的PALV分离毒株及血液样本为检测对象,分析qRT-PCR检测方法的实际检测效果。测序结果显示我国流行的不同血清型PALV毒株Seg-7序列高度保守,且与日本毒株的核酸序列相似度为99.59%~99.80%。建立的PALV群特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性与准确性:可检测PALV最低核酸拷贝数为23拷贝,与蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒、西藏环状病毒、云南环状病毒、广西环状病毒、牛流行热病毒以及阿卡斑病毒之间无交叉反应;对我国不同血清型的PALV分离毒株及分离病毒的血液样本的检测结果吻合率达到100%。对120份临床血液样本进行PALV核酸与抗体检测结果显示:qRT-PCR检测阳性率为35%,而抗体C-ELISA检测阳性率为30%,二者吻合率为85.7%。本研究提示PALV的Seg-7序列高度保守,可作为病毒核酸检测的靶基因。本研究所建立的PALV群特异性qRT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、可靠性好的优势,为开展PALV诊断与流行病学监测提供了新的技术手段。

云南省中山病毒的分离鉴定

为掌握云南省虫媒病毒的流行情况及基因分型,本试验在云南省师宗、江城和芒市设立监控点,对哨兵动物定期采血来监测其血清转阳情况,将阳性样品在BHK上传代以分离病毒,用RT-PCR及MNT鉴定病毒,通过特异性引物扩增分离毒株的Segment2(Seg-2)及Segment7(Seg-7)基因片段来分析其遗传特性。结果显示,在2014年从师宗监控点分离得到4株帕利亚姆病毒(PALV),经鉴定均为中山病毒(Chuzan virus,CHUV),并掌握了分离株Seg-2及Seg-7基因片段的遗传特征。本试验确认了CHUV在云南省的分离,为进一步掌握CHUV在中国的流行病学、致病性以及疫苗研究奠定良好基础。