日本血吸虫新基因SjPP的筛选、克隆及对小鼠的免疫效果

目的筛选克隆东方田鼠血清识别的日本血吸虫靶抗原基因,并研究其免疫保护效果。方法利用东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA表达文库获得阳性克隆,以5′RACE技术扩增获基因全长序列,构建含目的基因的核酸疫苗并研究在小鼠中的免疫保护效果。结果(1)获得4个日本血吸虫新的EST序列,即mfs-1(GenBank登录号BE974942)、mfs-3(GenBank登录号BE974944)、mfs-4(GenBank登录号BE974945)和mfs-5(GenBank登录号BE974946)。(2)mfs-5进行全长序列克隆,获得的日本血吸虫新基因SjPP(GenBank登录号AY902477)长1311bp,编码302个氨基酸,理论分子量为34.7kD,等电点为5.51;其氨基酸序列具有丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(serine/threoninespecificproteinphosphatase,简称PP)的保守序列LRGNHE,并且含有该酶特异性抑制剂冈田酸的作用位点SAPNYC,与人的PP6、鼠PP6、果蝇PPⅤ等蛋白的氨基酸序列具有高度同源性,分别达72%、70%和70%。(3)成功构建核酸疫苗pCMV-Script/SjPP,免疫BALB/c小鼠诱导产生肝组织减卵率为23.91%,粪便减卵率为31.91%。结论(1)获得日本血吸虫新的抗原基因SjPP。(2)含SjPP基因的核酸疫苗在小鼠中诱导了部分免疫保护效果。

姜黄素抗血吸虫病肝纤维化作用机制的研究

目的探讨姜黄素(CUR)在血吸虫病肝纤维化治疗中的作用。方法将60只小鼠随机分为6组,分别为对照组,感染组,溶剂组,CUR组(分低、中、高3个剂量)。CUR组于感染后第4周末开始通过灌胃给予CUR,感染后第10周末处死各组小鼠,剖取肝脏测定肝组织羟脯氨酸(Hyp),并检测肝脏基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)mRNA和组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)mRNA的表达水平。结果与感染组比较,肝组织中Hyp、胶原在CUR(低、中、高)组降低显著(t_(Hyp)=4.52、3.16、2.52,P<0.05、P<0.01;t_(胶原)=33.72、23.54、18.80,P<0.05、P<0.01);反转录PCR结果显示,随着CUR剂量的增加,MMP-1 mRNA的表达逐渐升高,TIMP-1 mRNA的表达逐渐降低,与感染组相比差异有统计学意义(t_(MMP-1)=16.98、21.43、25.49,P<0.05、P<0.01;t_(TIMP-1)= 40.20、37.59、34.23,P<0.05、P<0.01)。结论CUR有减轻肝组织损伤程度,延缓和阻止肝纤维化发生发展的作用,此作用可能与上调MMP-1,阻止TIMP-1的产生有关。

双向电泳联合免疫印迹技术分析日本血吸虫成虫可溶性抗原

目的建立及优化日本血吸虫成虫的蛋白质组学分析方法,寻找可溶性蛋白组分中与免疫应答相关的特异性成虫抗原。方法纯化日本血吸虫成虫可溶性蛋白,应用双向电泳(2D-E)结合免疫印迹技术(Western blotting),获得相应的电泳图谱和免疫印迹图谱,应用PDQuest8.0双向电泳图像分析软件对图像进行分析比对,鉴别特异性抗原。结果血吸虫成虫可溶性蛋白经双向电泳后,考马斯亮蓝G250染色,电泳图谱显示约152个主要蛋白斑点。分子量(Mr)分布约为14～114kD;等电点(pI)主要集中在4.9～9.5。进一步的Western blotting鉴定结果显示:实验组图像可见的抗原抗体反应点数目约57个,对照组为0。结论双向电泳联合免疫印迹技术是成功分析蛋白质组学的技术关键,该技术为寻找日本血吸虫特异性抗原开辟了新途径。

安徽省宁国市有螺无病地区钉螺对日本血吸虫易感性的研究

目的研究安徽省有钉螺无血吸虫病流行地区(简称"有螺无病地区")钉螺对日本血吸虫的易感性,为制定该类地区血吸虫病防治策略提供依据。方法采集宁国市有螺无病地区钉螺400只,随机分为2组,每组200只,以本省日本血吸虫毛蚴在实验室内进行钉螺群体感染,两组钉螺与毛蚴比例分别为1∶20和1∶40,感染时间为4小时,感染时的温度为24～28℃。以同样方法感染该省血吸虫病流行区宣城市有螺有病地区钉螺作为对照。感染后将钉螺置于室内常温下饲养60天,观察有螺无病地区和有螺有病地区钉螺感染率和死亡情况。结果在1∶20(钉螺/毛蚴)组和1∶40(钉螺/毛蚴)组中,有螺无病地区钉螺均未能成功感染日本血吸虫毛蚴,而有螺有病区钉螺感染率分别为5.89%(2/51)和16.67%(7/42),且两组中有螺有病区钉螺感染率的差异具有统计学意义(χ2=4.15,P<0.05)。观察期结束时,在1∶20(钉螺/毛蚴)组中,有螺无病地区钉螺与有螺有病地区钉螺死亡率分别为77%(154/200)和74.5%(149/200),两地钉螺死亡率无显著性差异(χ2=0.661,P>0.05);在1∶40(钉螺/毛蚴)组中,两地钉螺死亡率分别为81%(162/200)和78%(156/200),死亡率差异无统计学意义(χ2=0.507,P>0.05)。结论尽管本研究中有螺无病地区钉螺未能成功感染日本血吸虫毛蚴,但今后仍需加强有螺无病地区输入性血吸虫病传染源的监测工作。

日本血吸虫组织蛋白酶B2在小鼠抗血吸虫再感染中的作用

目的构建日本血吸虫组织蛋白酶B(Sjcb2)真核表达载体,检测日本血吸虫组织蛋白酶B2单独和联合吡喹酮(PZQ)在小鼠抗血吸虫再感染中的作用。方法将60只BALB/c雌性小鼠随机均分为六组,建立日本血吸虫感染动物模型:感染组、感染攻击组、空质粒处理组、Sjcb2免疫组、吡喹酮处理组、Sjcb2联合吡喹酮处理组。Sjcb2免疫组和Sjcb2联合吡喹酮组分别在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接种pcDNA3.1(+)/Sjcb2重组质粒,空质粒处理组接种pcDNA3.1(+)空质粒。初次尾蚴感染后第六周,对吡喹酮处理组和Sjcb2联合吡喹酮处理组小鼠给予PZQ治疗。除感染组外其它各组在第八周再次进行尾蚴攻击感染。分别于第8周和第14周取各组小鼠肝脏组织做病理切片,观察虫卵肉芽肿大小;采用间接ELISA法检测血清中特异性IgE和IgG亚型(IgG1,IgG2和IgG3);检测各组小鼠荷成虫数,计算抗血吸虫再感染率。结果 Sjcb2免疫组、联合组与其它组分别比较,小鼠荷虫数显著性减少,抗血吸虫再感染率显著升高,虫卵肉芽肿直径显著减小,IgG1水平显著下降和IgE水平显著升高(P<0.01)。结论 Sjcb2在小鼠模型中具有抗日本血吸虫再感染作用,抗血吸虫再感染率为70.3%,抗再感染作用机制可能与特异性IgE水平升高和IgG1水平下降有关。