不同方法共移植的嗅鞘细胞和雪旺氏细胞在损伤脊髓内的迁移和对轴突再生的影响

目的:观察经不同方法共移植的嗅鞘细胞和雪旺氏细胞在脊髓内的迁移特点和对轴突再生的影响。方法:将8只75±1d雌性SD大鼠随机分为2组,每组4只,利用NYU打击器制作T10脊髓损伤模型,打击高度25mm,打击杆重量10g。造模后2周,一组采用联合移植,雪旺氏细胞移植于损伤部位中心,嗅鞘细胞移植于距离损伤中心0.5mm处的头侧和尾侧的脊髓中线上;另一组采用混合移植,将嗅鞘细胞和雪旺氏细胞混合后移植于距离损伤中心0.5mm处的头侧和尾侧的脊髓中线上。每个部位注射4个点,深度为1.75mm、1.25mm、1mm、0.5mm,注射速度为0.1μl/min。联合移植组嗅鞘细胞量每点0.5μl含5×104个,雪旺氏细胞量为每点1μl含105个雪旺氏细胞;混合移植组为每点1μl含嗅鞘细胞和雪旺氏细胞各5×104个。细胞移植后1周和8周时各组分别取2只大鼠,以损伤部位为中心取包含细胞移植部位的脊髓,荧光和共聚焦显微镜下观察细胞迁移情况,利用神经丝(neurofilment,NF)和生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)免疫荧光染色观察移植细胞对轴突再生的影响。结果:两组中均可见嗅鞘细胞迁移,主要在灰质和白质内沿脊髓纵轴向损伤部位迁移,还分别有一小部分沿中央管和蛛网膜下腔迁移;但雪旺氏细胞仅在与嗅鞘细胞混合移植于距离损伤中心0.5mm处的头侧和尾侧脊髓时才可见有限距离的迁移。联合移植时,NF阳性(NF+)和GAP-43阳性(GAP-43+)纤维伴随嗅鞘细胞迁移而沿脊髓纵轴延伸,雪旺氏细胞移植处可见NF+纤维从各个方向长入损伤部位(移植部位)并互相缠绕;混合移植时,大量NF+纤维伴随移植细胞迁移而延伸,损伤部位虽然NF+纤维较少,但没有互相缠绕现象。结论:雪旺氏细胞在损伤脊髓内迁移能力差;嗅鞘细胞不仅具有良好的迁移能力,而且可促进雪旺氏细胞迁移。无论是联合移植还是混合移植,移植细胞均能促进轴突再生,但联合移植时雪旺氏细胞移植处再生纤维互相缠绕、无法延伸。

聚四氟乙烯膜管内植入自体许旺氏细胞桥接面神经的实验研究

目的观察聚四氟乙烯膜管内植入自体许旺氏细胞桥接修复面神经缺损的效果。方法采用聚四氟乙烯膜管桥接家兔面神经1.0cm的缺损,将快速提取获得的自体许旺氏细胞植入膜管内作为实验组,选择单纯聚四氟乙烯膜管桥接面神经缺损为对照组,用电生理测试和组织学观察等方法对修复后不同时期神经再生情况进行评价。结果实验组各时期神经再生情况均优于对照组,其中实验组术后16周时面神经传导速度为29·70m/s,而对照组为23·00m/s,统计学处理两者有显著性差异(P<0·05)。结论一定数量有活力的自体许旺氏细胞植入聚四氟乙烯膜管制成的面神经再生室内,可以获得较好的面神经修复效果。

血清对联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞的影响

目的:探讨血清对联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞的影响,进一步寻求诱导神经上皮干细胞定向分化的影响因素。方法:采用不同浓度血清联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞,收集上清液作为条件培养液,免疫细胞化学染色观察条件培养液诱导神经上皮干细胞分化,统计分析分化为神经元与星形胶质细胞的比例;MTT检测条件培养液促Schwann细胞存活及增殖的作用。结果:Schwann细胞促进神经上皮干细胞存活和分化,随着血清浓度增加,神经上皮干细胞分化形成的神经元比例减少;神经上皮干细胞及血清均促进Schwann细胞存活和增殖,随血清浓度增加,存活及增殖率增加。结论:无血清或较低血清浓度有利于共培养的Schwann细胞存活和增殖,同时也有利于共培养神经上皮干细胞存活和向神经元方向分化。

吡咯喹啉醌对大鼠雪旺细胞增殖及其EGR1、EGR2基因表达的影响

目的观察吡咯喹啉醌(PQQ)对大鼠雪旺细胞的促进增殖作用及其EGR1、EGR2基因表达的影响。方法体外原代培养大鼠雪旺细胞,纯化及S-100免疫荧光鉴定;加入PQQ进行培养,使PQQ终浓度分别为0、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L,持续作用72 h,提取总RNA进行RT-PCR,检测EGR1及EGR2基因的表达变化。结果PQQ可促进雪旺细胞增殖并改变其形态,1～1 000 nmol/L的PQQ可使EGR1、EGR2基因表达增高,10 000 nmol/L时抑制EGR1及EGR2基因的表达。结论PQQ可促进大鼠雪旺细胞增殖并改变其形态,使雪旺细胞ERG1及EGR2基因表达上调。

髓磷脂碱性蛋白在涎腺腺样囊性癌中的表达

目的:利用免疫组化方法研究雪旺氏细胞标记物髓磷脂碱性蛋白(MBP)在腺样囊性癌中的表达,探讨腺样囊性癌中肌上皮细胞向雪旺氏细胞分化与腺样囊性癌嗜神经侵袭之间的关系。方法:对17例腺样囊性癌标本进行MBP免疫组化染色,利用双重免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜技术检测MBP和肌上皮标记物MA在腺样囊性癌中的共表达。结果:17例腺样囊性癌中有6例MBP免疫组化染色呈阳性反应,双重免疫荧光染色发现MBP与MA在同一腺样囊性癌细胞的胞浆中表达。结论:腺样囊性癌中的肌上皮细胞发生了雪旺氏分化,推测这种分化与腺样囊性癌嗜神经侵袭密切相关。

雪旺细胞促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的效应研究

目的建立一个较好的诱导骨髓间充质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的新方法。方法应用Brdu脉冲标记MSC,使其与雪旺细胞共培养,令大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。观察细胞形态学变化,并在分化后的MSC细胞中,应用免疫细胞化学检测NSE、Brdu的表达,蛋白印迹技术检测NeuN的表达。分析诱导分化后MSC的分化率。结果与雪旺细胞共同培养的MSC表达NSE和NeuN,其分化为神经元样细胞的分化率为(80.51±5.65)%。结论 MSC与雪旺细胞共培养可以分化MSC为神经元样细胞。

髓鞘特异蛋白PMP22和MBP在腓肠神经活检标本中表达差异及其意义

目的探讨周围髓鞘蛋白22(peripheral myelin protein 22,PMP22)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic pro-tein,MBP)在周围神经活检标本中的表达差异及其诊断意义。方法收集35例成人腓肠神经活检标本,进行抗PMP22、MBP免疫组织化学染色,对其灰度值做定量分析,并与相应的光镜和电镜下组织学形态进行比较分析。结果 PMP22和MBP的表达部位并不完全相同;PMP22表达水平与有髓纤维髓鞘的残存数目、完整程度及无髓纤维-Schwann细胞单位的数量、功能状态等多个因素相关;MBP表达水平主要与残存的有髓纤维的数量和髓鞘脱失的程度相关;两者的表达具有一定的相关性,但PMP22更多反映Schwann细胞状态,而MBP反映有髓纤维髓鞘的状态。结论周围神经活检中PMP22和MBP的检测有助于判断受损髓鞘的神经纤维分布以及Schwann细胞的功能状态,可考虑作为周围神经活检诊断的常规检测。

Wnt信号通路对体外培养小鼠雪旺细胞增殖及其促进神经元轴突生长作用的研究

目的研究Wnt/β-catenin信号通路在加入GSK-3β抑制子后促雪旺细胞增殖过程中的作用,探讨雪旺细胞促进神经元轴突生长的可能的信号分子机制。方法体外培养纯化雪旺细胞,S-100免疫荧光鉴定;采用GSK-3β抑制子作用雪旺细胞,观察雪旺细胞的形态学改变并计数;培养小鼠背根神经节神经元,与活化的SCs细胞共培养,用Western blot检测β-catenin在与活化的雪旺细胞共培养的神经元内的表达情况,评价其促神经元轴突生长的功能特性。结果 GSK-3β抑制子可促使雪旺细胞发生形态学上的变化及增殖;Western blot的结果表明GSK-3β抑制子可使神经元内β-catenin表达增加。活化的SCs细胞与背根神经节神经元共培养,与未活化的SCs细胞共培养的神经元相比,其神经元轴突长度显著增长,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Wnt信号通路活化后可使体外培养的雪旺细胞发生形态学变化及增殖,Wnt/β-catenin通路在促进雪旺细胞的生长过程中发挥作用;活化的雪旺细胞与神经元共培养,使神经元轴突增长及β-catenin表达增高。

大鼠原代背根神经元和雪旺细胞在随机及有序排列聚甲基丙烯酸甲酯电纺纳米纤维上共培养的形态学

目的:探讨聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)电纺纳米纤维支架的拓扑线索对于大鼠原代背根神经元(DRGn)培养及其与雪旺细胞(SCs)共培养的影响。方法:构建具有随机分布和轴向有序排列拓扑结构的PMMA电纺纳米纤维,分别为随机和有序PMMA电纺纳米纤维组,以PMMA薄膜作为对照组;分离纯化大鼠原代DRGn和SCs,与上述各组PMMA电纺纳米纤维共培养;利用慢病毒技术转染荧光蛋白基因作为显色方法,观察PMMA电纺纳米纤维的拓扑线索对于DRGn神经突生长的影响,在共培养实验通过荧光图像的快速傅立叶转换(FFT)及半高全宽值(FWHM)的计算,定量分析电纺纤维对DRGn神经突和SCs细胞突起的接触引导作用。结果:大鼠原代DRGn和SCs均能够顺利在PMMA材料上贴壁并生长;与PMMA薄膜组比较,随机和有序PMMA电纺纳米纤维组DRGn平均神经突数量及神经突长度差异无统计学意义(P>0.05);共培养实验中,电纺纤维的拓扑线索对于DRGn神经突和SCs细胞突起的生长均具有明显的接触引导作用,与PMMA薄膜组和随机PMMA电纺纳米纤维组比较,有序PMMA电纺纳米纤维组DRGn和SCs的FWHM值均明显降低(P<0.01),有序PMMA电纺纳米纤维能够在空间上促成DRGn神经突和SCs细胞突起建立共定位。结论:有序PMMA电纺纳米纤维具有作为脊髓损伤(SCI)后植入性支架材料的潜力,其拓扑线索有可能加速SCs的轴突髓鞘化过程。

自体施万细胞神经膜管移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究

目的探讨自体施万细胞神经膜管(SCNC)移植对脊髓半横断损伤的修复作用。方法成鼠30只,随机分3组:10只造模后行SCNC移植(A组);10只造模但不移植(B组);10只不造模也不移植作正常对照组(C组)。下段胸髓半切法造模。术后8周每周行动物行为测试和斜板试验;术后6周测定皮层体感诱发电位(CSEP);术后8周行组织学观察及计算机图像分析。结果A组、C组可测出CSEP波形,B组未测出。行为测试、斜板试验及图像分析A组、C组与B组差异显著,A组与C组之间斜板试验有显著差异。A组通过脊髓损伤处的再生神经纤维数量明显多于B组。结论自体施万细胞神经膜管移植有助于引导再生轴突生长通过,对损伤脊髓再生有较明显的促进作用。

大鼠神经干细胞和雪旺细胞体外共培养生长特性

目的:探讨雪旺细胞(SC)对神经干细胞(NSC)的生物作用,为临床移植神经细胞提供依据和方法。方法:将神经干细胞分别在有雪旺细胞骨架、分泌物及活雪旺细胞饲养层的不同环境中培养,同时设立各自对照组,观察神经干细胞迁徙、贴壁能力、分化、细胞代谢、轴突生长、免疫组化神经丝染色情况。结果:与雪旺细胞有关的实验组神经干细胞大量分化为具有细长突起的细胞,神经丝(NF)标记阳性细胞多,突起长(特别是经胎牛血清培养过的雪旺细胞实验组),细胞贴壁力强,细胞生长代谢旺盛,突起粗壮并且生长速度快。结论:雪旺细胞能促进神经干细胞分化,并促进其生长。

人NT-3基因转染对雪旺细胞生物学行为的影响

目的观察神经营养素-3(NT-3)基因转染对雪旺细胞生物学行为的影响。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,从人肝脏组织总RNA中克隆NT-3cDNA,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT-3;应用混合酶消化法分离、纯化雪旺细胞;采用阳性脂质体介导法将重组质粒pIRES2-EGFP-NT-3转染雪旺细胞,观察外源性NT-3对雪旺细胞生物学行为的影响。结果成功地从人肝脏组织中克隆了NT-3cDNA,构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT-3;分离、纯化得到了高纯度的雪旺细胞;将重组质粒转染雪旺细胞,与对照组相比,转染NT-3基因的雪旺细胞形态正常;经NT-3抗体免疫组化染色见NT-3转染组雪旺细胞胞浆呈深棕色着色,轴突着色清晰可见,与对照组相比,明显变长;空载体转染组及空白对照组胞浆及轴突着色均较淡;对各组细胞胞浆着色进行半定量分析,结果表明NT-3基因转染组灰度值显著高于对照组(P<0.01)。结论NT-3基因转染后雪旺细胞NT-3含量明显增加,轴突变长,本实验结果有望为面神经损伤后的修复提供新的途径。

大鼠坐骨神经损伤后局部自噬激活的动态变化

目的观察大鼠坐骨神经压迫(CCI)模型中,自噬在坐骨神经中的动态变化。方法将36只雄性SD大鼠分为假手术组(Sham组)和坐骨神经结扎组(CCI组)各18只。以大鼠机械性缩足反射阈值评价疼痛,于术前1 d测定足底基础痛阈值,术后1、4、7 d再次评定。术后4、7 d,取术侧坐骨神经,采用蛋白免疫印迹法检测微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、自噬底物P62表达水平,用免疫荧光标记LC3,于透射电镜下观察自噬体的形成。结果 CCI模型中大鼠疼痛阈值降低,具有明显病理性疼痛行为学改变。与Sham组比较,CCI组术后4 d LC3-Ⅱ蛋白水平增高,P62蛋白表达减少(P均<0.01);至术后7 d,LC3-Ⅱ蛋白水平进一步上升(P<0.001),P62蛋白表达水平也较术后4d高(P<0.05)。电镜下可见,CCI组中的术后4 d组及术后7 d组的施万细胞及神经元轴突均出现自噬体。结论在大鼠CCI模型中,坐骨神经轴突及施万细胞的自噬被激活,且大鼠坐骨神经损伤后局部自噬激活发生了动态变化。

间充质干细胞治疗周围神经损伤的研究进展

通过查阅文献,从周围神经损伤的发生原因、治疗方法及各种方法的利与弊、间充质干细胞与周围神经损伤治疗的关系、已取得的成绩、存在问题等方面进行分析总结。分析表明周围神经损伤很常见,目前无较好的解决办法,间充质干细胞及其诱导而来的类施万细胞有望成为其种子细胞。周围神经损伤及间充质干细胞的研究目前已取得很多成绩,但还有很多问题值得进一步研究,通过间充质干细胞诱导分化为类施万细胞治疗周围神经损伤前景非常广阔。

FK506促进乳鼠雪旺细胞增殖的实验研究

目的观察FK506对体外培养的乳鼠雪旺细胞增殖的影响。方法将纯化的雪旺细胞分两组,一组设为对照,另一种加含终浓度为0.5ng/mlFK506的DMEM/F12培养液培养,用MTT法检测不同时间点的OD值并绘制生长曲线,另在培养第48、72小时后用3H-胸腺嘧啶核甙测定法检测其DPM值。结果经含0.5ng/mlFK506培养液培养的雪旺细胞,其对数生长期提前出现,并且在峰值上高于对照组;接种后48h和72h,3H-胸腺嘧啶核甙检测DPM值实验组也高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论FK506有促进雪旺细胞分裂增殖的作用,可能是其促进周围神经再生的重要机制之一。

激活态雪旺细胞源性神经营养因子对胚芽干细胞向神经细胞分化的影响

目的探索小鼠胚芽干细胞（embryonic germ cells，EGCs）分离、培养的有效方法；观察激活态雪旺细胞（activated Schwann cells，ASCs）源性神经营养因子对小鼠EGCs向神经细胞分化的影响。方法分离受精11d胚胎小鼠生殖腺嵴及同时取少量的腹键组织共同消化培养，经胰蛋白酶消化制备成EGCs恳液，将细胞种植在饲养层细胞上。观察小鼠EGCs集落形成情况，并采用阶段特异性胚胎抗原-1染色、碱性磷酸酶染色、过碘酸－雪夫染色对其进行鉴定。采用双酶消化组织块法结合机械分离法分离培养ASCs。神经诱导实验采用基础培养基＋小鼠EGCs（空白对照组）和ASCs培养基与小鼠EGCs共培养（实验组），培养3周后对神经诱导结果进行NeuN、MBP、GFAP免疫荧光染色鉴定，计算细胞染色阳性牢，对实验结果进行统计学分析。结果小鼠EGCs呈集落性生长，集落隆起、多数呈鸟巢状、与周围饲养层细胞存在明显界限；集落内的细胞密集，呈现一个或几个核仁、核质比高的圆形或卵圆形；阶段特异性胚胎抗原－l染色、碱性磷酸酶染色、过碘酸－雪夫染色均阳性。小鼠EGCs神经诱导1周后，倒置相差显微镜下可见EGCs克隆的边缘出现向外迁移的细胞，圆形或椭圆形，部分细胞有突起伸出。3周后，迁移的、有细长突起的细胞越来越多，NeuN、MBP、GFAP免疫荧光染色均阳性。细胞染色阶陆率比较羞异有统计学意义。结论通过一种简单、经济的方法体外成功分离并获得小鼠EGCs；ASCs源性神经营养因子能够促进小鼠EGCs存体外向神经细胞分化。

大鼠脊髓损伤后PLGA支架细胞髓内移植的组织学观察

目的观察神经干细胞（NSC）、许旺细胞（SCs）和组织工程材料乙交酯-丙交酯共聚物（PLGA）大鼠髓内共移植后的病理形态学改变。方法36只Wistar大鼠，随机分为PLGA移植组、NSC／PLGA组和NSC＋SCs／PLGA组。体外培养、鉴定胚胎脊髓源NSC和SCs，制备和构建PLGA支架细胞复合体并移植到大鼠脊髓T9半横断损伤部位，应用HE染色、电镜和免疫组织化学染色方法在形态结构上观察材料的组织相容性、轴突髓鞘再生及NSC在脊髓内的存活、迁移和分化情况。结果HE染色观察损伤12周时移植材料内可见细胞生长及新生的毛细血管；扫描电镜观察随着时间的延长，PLGA逐渐降解；材料正中横断面透射电镜观察可见新生的无髓及有髓神经纤维；脊髓标本免疫组织化学染色可见移植的NSC可以在宿主脊髓内存活、迁移并分化成类神经元样细胞和少枝胶质细胞，未分化成星形胶质细胞。结论NSC、SCs和PLGA共移植可以在形态学上促进大鼠脊髓半横断损伤的修复。

激活态雪旺细胞源性神经营养因子对脐血间充质干细胞分化的影响

目的观察激活态雪旺细胞（ASCs）分泌神经营养因子对诱导人脐血间充质干细胞（HUCBMSCs）神经方向分化的作用。方法采用双酶消化组织块法结合机械分离法分离培养ASCs；Ficoll法分离得到人脐血单个核细胞（HCMNCs）并经贴壁培养、分离后获得HUCBMSCs。采用全反式微甲酸＋碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）＋表皮生长因子（EGF）（对照组）、ASCs培养基半量换液法（实验组）。应用免疫组织化学、蛋白印迹法（Westernblot）半定量、荧光实时聚合酶链反应（Real—timePCR）[神经纤维200（NF200）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、髓磷脂碱性蛋白（MBP）]定量分析等方法在诱导培养后1、2、3、4周进行综合评价HUCBMSCs诱导分化，对实验结果进行统计学分析。结果免疫组织化学染色结果证实HUCBMSCs在ASCs和全反式微甲酸及bFGF、EGF的作用下向神经源性细胞分化。不同诱导时间细胞阳性率、Westernblot半定量、Real—timePCR定量分析结果显示差异有统计学意义（P〈0．05），而同一时间内两种诱导方法比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论ASCs可以分泌多种神经营养因子并促进HUCBMSCs向神经源性细胞分化，与传统全反式微甲酸诱导方法比较更简单。

激活态雪旺细胞信号转导通路的分子构成

目的探索激活态雪旺细胞信号转导通路的分子构成。方法用改良成年SD大鼠雪旺细胞培养法获得激活态和正常态雪旺细胞，分别用RTK和G蛋白耦联的信号转导通路中的7个抑制剂后，Western Blot法检测细胞内的p-ERK1／2水平的改变。比较激活态和正常态雪旺细胞的信号转导通路的差异。结果Western Blot法检测结果显示，在激活态雪旺细胞，使用抑制剂CTX、D609和BAPTA-AM后细胞内的p-ERK1／2水平显著降低（P〈0．01），而其它抑制剂使用后细胞内的p-ERK1／2水平无明显的改变。在正常态的雪旺细胞，使用抑制剂U73122和BAPTA-AM后细胞内的p-ERK1／2水平显著降低，而其它抑制剂使用后细胞内的p-ERK1／2水平无明显的改变，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论激活态雪旺细胞和正常态雪旺细胞都是通过G蛋白耦联信号转导通路来发挥生物效应，但是激活态雪旺细胞通过PC-PLC分解磷脂酰胆碱使细胞内的DAG水平的提高来发挥生物效应．而正常态雪旺细胞则通过PI—PIE信号转导通路发挥其生物效应。

新生SD大鼠坐骨神经雪旺细胞传代培养实验研究

目的探索简便可行的、可以获得高纯度的雪旺细胞的培养方法。方法选用4～5d的SD大鼠将双侧坐骨神经进行结扎预变性,术后7d采用在解剖镜下剥离除去神经外膜,剪碎后采用双酶消化法和原代培养4d后G-418纯化法进行雪旺细胞培养,并对培养的细胞进行细胞计数、活力测定和免疫组织化学染色法鉴定。结果从新生鼠可获取近3.84x106个雪旺细胞,成活率为95.6%,免疫组织化学染色法鉴定雪旺细胞纯度达94%以上。结论建立的方法可以获得大量纯度高、活性良好的雪旺细胞,值得进一步推广。