垫状卷柏SpLEA1基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

晚期胚胎发育丰富蛋白(late embryogenesis abundant,LEA),广泛存在于生物体内,与植物抗逆性密切相关,可在干旱胁迫下保护植物细胞,减少植物损伤。垫状卷柏(Selaginella pulvinata)是一种在干旱胁迫下生存能力极强的蕨类植物,具有很强的恢复能力。为探究垫状卷柏SpLEA 1基因在耐旱植物中的分子机制与表达特征,该研究以高耐旱性植物垫状卷柏为实验材料,基于转录组测序结果,采用RT-PCR技术获得SpLEA 1基因cDNA序列,采用HiTail-PCR技术获得启动子序列,利用生物信息学对序列进行了分析,并采用qRT-PCR技术分析了SpLEA 1基因在干旱胁迫下的表达模式。结果表明:(1)垫状卷柏SpLEA 1全长为476 bp,开放阅读框(ORF)为279 bp,共编码92个氨基酸,通过在线工具预测到蛋白分子量为9491.46 Da,等电点为5.45,蛋白结构预测分析表明该蛋白为亲水性蛋白,含有10个磷酸化位点,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。(2)预测到SpLEA1蛋白的保守结构域为Lea-5,来源于LEA1家族。基于系统发生树和遗传距离矩阵,发现垫状卷柏SpLEA1与来自鹰嘴豆(Cicer arietinum)和红车轴草(Trifolium pratense)的Lea-5蛋白同源性较高。(3)对启动子序列进行顺式作用元件的预测分析发现SpLEA 1基因启动子含有5类激素响应元件和与干旱胁迫响应有关的功能元件。(4)在自然干旱处理下SpLEA 1基因表达上调,并在12 h时达到峰值,在24 h干旱后进行复水处理,表达量显著下调。综上所述,SpLEA 1基因在垫状卷柏中很可能参与了干旱胁迫响应机制的相关调控。该结果为进一步研究垫状卷柏SpLEA 1基因在干旱胁迫下的功能及其表达调控机制提供了参考。

垫状卷柏的化学成分研究

从垫状卷柏分离纯化得到 4个化合物 ;经波谱方法分别鉴定化合物结构为 :β 谷甾醇 ( 1) ,穗花杉双黄酮 ( 2 ) ,2 4 乙基 -胆甾 4 烯 3 ,6 二酮 ( 3 ) [垫状卷柏胆甾酮 (Pulvinatadione) ]和 5 ,5″ ,4 三羟基 7,7″ 二甲氧基 [4′ O 6″]双黄酮 ( 4 ) [垫状卷柏双黄酮 (Pulvinatabiflavone) ] ,其中化合物 3和 4为新化合物 .

垫状卷柏中双黄酮药理活性的研究

目的观察穗花杉双黄酮和垫状卷柏双黄酮清除自由基的作用和对溶血性磷脂酰胆碱(LPC)诱导的血管内皮细胞损伤的保护。方法检测二苯代苦味肼基自由基(DPPH)反应;培养内皮细胞,测定乳酸脱氢酶(LDH)活性与MTT比色法测定细胞活性。结果穗花杉双黄酮和垫状卷柏双黄酮能清除DPPH自由基,能显著抑制LPC所致内皮细胞LDH的泄漏,抑制LPC所致细胞活性的降低。结论穗花杉双黄酮与垫状卷柏双黄酮均能浓度依赖性地清除DPPH自由基,并能显著减轻LPC所致的ECV304细胞损伤。

垫状卷柏中双黄酮抑制黄嘌呤氧化酶的活性研究

目的:探寻垫状卷柏中抑制黄嘌呤氧化酶的活性部位。方法:采用黄嘌呤氧化酶体外抑制实验测定各组分的半数抑制浓度IC50。结果:三个双黄酮成分的混合物Fr5对黄嘌呤氧化酶有强抑制作用(IC50=1.1μg/ml),Fr5继续分离得到的两个组分Fr5-1(IC50=2.9μg/mL)和Fr5-2(IC50=24.0μg/mL),其纯度增高但活性不及Fr5,当重新组合这两个组分时,活性仍然不能恢复或增强。结论:垫状卷柏中对黄嘌呤氧化酶抑制作用最强的部分是三个双黄酮类成分的混合物,继续分离活性减弱。

垫状卷柏提取物诱导凋亡抗肿瘤作用研究（英文）

目的研究垫状卷柏提取物抗肿瘤作用及相关机制。方法采用皮下接种H22肝癌细胞株构建小鼠H22肝癌移植瘤模型,随机分为对照组(生理盐水)、5-FU组(30 mg/kg)、垫状卷柏提取物(SP)高、低剂量组(189、63 mg/kg),连续灌胃15 d。观察小鼠肿瘤生长情况,计算抑瘤率及肝、脾、胸腺指数;TUNEL法观察肿瘤组织细胞凋亡,Western blot测定凋亡相关蛋白的表达,qPCR检测Bax mRNA和Bcl-2 mRNA。结果与对照组比较,SP高、低剂量组小鼠体质量及肝、脾、胸腺指数均无显著差异;SP高、低剂量组小鼠的肿瘤质量均显著降低,呈现较高抑瘤率(P<0.01),且高剂量组与5-FU组相近;经TUNEL染色法观察,可见明显凋亡形态改变。qPCR检测表明,SP显著上调Bax mRNA的表达,下调Bcl-2 mRNA的表达。Western blot结果显示SP处理后,Bax、cytochrome c及cleaved caspase-3,caspase-8和caspase-9的表达显著上调(P<0.01),Bcl-2表达明显减弱,呈剂量依赖性。结论 SP有效抑制H22小鼠体内肿瘤生长,其机制与激活caspase诱导凋亡相关。

旱生复苏植物垫状卷柏对铅的超富集特性研究

通过对处于干热河谷的四川省汉源县唐家铅锌矿区及周围污染农田进行优势植物采样分析发现,垫状卷柏（Selaginella pulvinata）的地上部分、根系铅（Pb）积累量分别为672.10mg/kg和313.59mg/kg,转运系数为2.14,可能是一种新的铅超富集植物。为此,通过浓度梯度盆栽试验进一步进行验证,结果表明,垫状卷柏在铅质量浓度为600 mg/L时地上部分富集量为1 061.65 mg/kg,超过了铅富集量的临界值（1 000mg/kg）,并且其地上部分富集系数和转运系数分别为1.77和2.62,均大于1。此外,垫状卷柏在铅处理浓度为200~600mg/L时,无明显的受害症状,且其单株地上部分生物量在600mg/L时达7.67g,抗性系数达0.923,单株地上部分提取量达8 147.80μg,提取1g铅仅需123株。垫状卷柏是一种铅超富集植物,具有较高的应用价值,可作为干热河谷铅锌矿区植被生态恢复和铅污染土壤的植物修复材料。

垫状卷柏化学成分的研究

目的研究垫状卷柏Selaginella pulvinata(Hook.&Grev.)Maxim.的化学成分。方法垫状卷柏95%乙醇提取物采用MCI、硅胶、C18柱、Sephadex LH-20进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离得到8个化合物,分别鉴定为穗花杉双黄酮(1)、黑麦草内酯(2)、丁香酸(3)、selaginpulvilin A(4)、selaginellin(5)、2,6-dihydroxy-3,4-dimethylbenzoic acid methyl ester(6)、pratensein-7-O-β-D-glucopyranoside(7)、4-ethoxy benzoic acid(8)。结论化合物2、6~8均为首次从卷柏属中分离得到。

垫状卷柏中化学成分的分离及其抑制肿瘤细胞增殖活性

利用质谱引导的自动纯化分离系统对垫状卷柏95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分进行选择性分离纯化双黄酮类、炔酚类化合物。并利用MS、^(1)H NMR、^(13)C NMR、2D NMR等光波谱分析方法确定结构,结果得到四个双黄酮类化合物,分别为扁柏双黄酮(1)、异柳杉双黄酮(2)、苏铁双黄酮(3)、穗花杉双黄酮(4),七个炔酚类化合物,分别为selaginellin(5)、selaginpulvilin A(6)、selaginpulvilin B(7)、selaginellin O(8)、selaginellin E(9)、selaginellin A(10)、selaginellin B(11)。采用MTT法评价了化合物1~11体外抑制人非小细胞肺癌细胞(NSCLC)H322增殖活性,结果表明,除化合物4和7外,其他化合物对人非小细胞肺癌细胞H322有不同程度的增殖抑制活性,其中化合物3和10抑制作用较强,IC_(50)值分别为16.70和9.54μmol/L。

中药卷柏的原植物鉴定

研究常用中药卷柏的原植物卷柏和垫状卷柏的植物学特征，明确两者的分类地位。观察两者的外部形态特征，并用扫描电镜观察它们的孢子和叶片表面特征。结果：两者在中叶形状，侧叶边缘齿，孢子纹饰、叶片表面特征方面均有差别。结论：垫状卷柏不宜作为卷柏的变种处理，应视为不同种。本工作为其分类学提供了新资料，可用于正确鉴定、合理应用卷柏类中药。

响应面法优选垫状卷柏中穗花杉双黄酮提取工艺

目的:建立垫状卷柏中穗花杉双黄酮乙醇提取的最佳工艺条件。方法:以穗花杉双黄酮提出量为考察指标,从乙醇浓度、提取时间、提取次数、加醇倍量4个方面进行单因素考察,选取最优条件设计垫状卷柏醇提工艺的响应面试验,确定最佳提取条件。结果:乙醇浓度70.6%、提取时间60 min、提取次数3次、加醇倍量12倍,穗花杉双黄酮提出量可以达到17.97 mg/g。结论:采用响应面法预测垫状卷柏醇提工艺的模型准确有效,可以较好的优选出垫状卷柏中穗花杉双黄酮的最佳提取工艺。

垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因的克隆及功能分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalose-6-phosphate synthse,TPS)是植物海藻糖合成途径的关键酶,在旱生卷柏等复苏植物对逆境胁迫应答中起重要作用。文章以我国特有旱生植物垫状卷柏(Selaginella pulvinata)为材料,采用同源扩增与RACE技术相结合的方法克隆了海藻糖-6-磷酸合成酶基因SpTPS1,cDNA全长3223bp,包括一个2790bp的开放阅读框,推导的氨基酸序列与模式物种的海藻糖-6-磷酸合成酶具有较高的序列相似性,催化活性中心保守位点基本一致。酵母功能互补实验证明,用SpTPS1基因开放阅读框转化的海藻糖合成酶基因突变(tps1△)酵母菌株,可恢复在以葡萄糖作为唯一碳源培养基上的生长,说明垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因SpTPS1的编码蛋白具有生物活性,可应用于植物抗逆性的转基因改良。

西藏首次发现垫状卷柏群落

报道了西藏自治区登曲河流域首次发现垫状卷柏群落.对该植物的形态结构、群落的演替规律及形成过程进行了初步研究;此次垫状卷柏群落的发现,丰富了西藏植被中垫状植被的类型,对水土保持也具有十分重要的意义.

垫状卷柏炔酚类化学成分研究

目的研究垫状卷柏中炔酚类化学成分。方法运用色谱法分离垫状卷柏75%乙醇提取物中的炔酚类化学成分,UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR波谱技术鉴定化合物的结构。结果分离得到3个炔酚类化合物,分别是selaginellin J(1)、selaginellin K(2)和selaginellin L(3)。结论 3个炔酚类化合物均为首次从该植物中分离得到。

正交实验法优选垫状卷柏总黄酮的提取工艺

目的探讨垫状卷柏中总黄酮的最佳提取工艺。方法采用正交实验法,以总黄酮含量为考察指标,优化垫状卷柏总黄酮的提取工艺。结果经过正交实验得出的最佳工艺条件为乙醇浓度95%,料液比1:12,提取时间为2 h,回流提取2次。结论根据验证实验结果,该方法工艺合理,稳定可行。

垫状卷柏的化学成分、药理作用现代研究及质量标志物(Q-marker)的预测分析

垫状卷柏化学成分多样,至今已发现黄酮类、炔酚类、苯丙素类、有机酸及有机酸酯类、生物碱类、甾体类、等化合物共计86种。垫状卷柏提取物表现出较好的抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化、降糖、护肝及止血等药理作用。本文对垫状卷柏的化学成分和药理作用进行梳理,并预测其质量标志物(quality marker,Q-Marker),建议将穗花杉双黄酮、罗波斯塔双黄酮、扁柏双黄酮、Selaginellin作为垫状卷柏单一成分类Q-Marker备选物质,以期为垫状卷柏进一步深入研究以及建立质量标准体系提供参考。

垫状卷柏中一个新的炔酚类衍生物(英文)

采用硅胶、Sephadex LH-20等多种材料进行分离纯化,通过理化方法和波谱分析进行结构鉴定,从垫状卷柏全草中分离并鉴定了两个炔酚类衍生物,分别为selaginellin S(1)和M(2)。其中,化合物1为新炔酚类衍生物,是炔酚类成分生源合成途径的关键前体物质;通过ECD计算确定了其绝对构型。化合物2为首次从该植物中报道。

两种卷柏属植物对人单核细胞白血病U937细胞的增殖和凋亡影响

目的:研究垫状卷柏、翠云草两种卷柏属植物对体外培养的人单核细胞白血病细胞U937细胞的增殖和凋亡的影响。方法:分别采用95%乙醇对两种植物采用冷浸和热提取两种提取方法,回收溶剂后萃取得乙酸乙酯和石油醚萃取物。采用噻唑兰比色法(MTT)检测不同浓度样品作用于U937细胞24h后的细胞增殖情况,Hoechst33342染色分析细胞形态学变化,Western Bolt检测凋亡蛋白表达情况。结果:MTT法分析表明垫状卷柏、翠云草提取物均对U937细胞的增殖抑制成剂量依赖性关系。其中垫状卷柏热提物效果最佳,其乙酸乙酯和石油醚萃取物均有良好抑制效果,乙酸乙酯萃取部位抑制作用更强; Hoechst33342染色发现随着提取物浓度升高,凋亡细胞增多; Western印记分析凋亡相关蛋白,其中Bax蛋白表达量增加,Bcl-2蛋白表达量减少,Caspase-3和Caspase-8蛋白表达量减少。结论:两种卷柏均能有效抑制U937细胞增殖,并且热提总提物抑制效果优于冷浸总提物,其中垫状卷柏热提总提物的乙酸乙酯萃取层初步认为可能是垫状卷柏抗肿瘤的有效部位,其诱导U937细胞凋亡与Caspase依赖性线粒体途径相关。

复苏植物垫状卷柏离体叶片光合作用对脱水和复水的响应

本研究对复苏植物垫状卷柏离体叶片进行脱水和复水处理,研究叶绿素含量、叶绿素荧光以及核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)总活性变化,旨在探究垫状卷柏光合作用对脱水和复水的响应。研究结果显示,垫状卷柏离体叶片叶绿素总含量在脱水和复水过程中没有发生显著变化,符合叶绿素保持型复苏植物的特征。PSII最大光化学效率(Fv/Fm)、非光化学淬灭(NPQ)、PSII有效光化学量子产量(Fv’/Fm’)以及PSII实际光化学量子效率(ΦPSII)随脱水时间的延长而降低,随复水时间的延长而上升;复水24 h时,各参数值趋近正常叶片数值。脱水和复水过程中的光合电子传递速率(ETR)快速光响应曲线与光强的变化趋势相似,但ETR数值在脱水时下降,复水时恢复。脱水过程中Rubisco总活性降低,复水时活性逐渐增加。上述结果表明垫状卷柏离体叶片光合作用在脱水过程中受到抑制,复水时逐步恢复。垫状卷柏叶片对脱水和复水的快速响应是应对脱水胁迫的重要策略。