抗EGFRvⅢCAR-T疗法联合Notch1通路抑制剂对人胶质瘤起始细胞自我更新能力的抑制作用

目的观察抗表皮生长因子受体vⅢ嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞(抗EGFRvⅢCAR-T)疗法联合Notch1通路抑制剂DAPT对人胶质瘤起始细胞(GICs)自我更新能力的抑制作用。方法将胶质母细胞瘤原代细胞分为DT007和DT008两部分,经干细胞成球培养后采用免疫磁珠法分选,Western blotting法及免疫荧光法鉴定为GICs,分别命名为PA37S和PA38S。取PA37S、PA38S两种细胞,每种细胞随机分为对照组(加入细胞培养液)、DAPT组(加入10µmol/L DAPT)、CAR-T组(加入慢病毒转染获得的抑制EGFRvⅢ表达的抗EGFRvⅢCAR-T淋巴细胞)、CAR-T+DAPT组(加入抗EGFRvⅢCAR-T淋巴细胞和10µmol/L DAPT),均培养24 h。采用Western blotting法检测细胞EGFRvⅢ、Notch1活化相关指标Hes1蛋白相对表达量,成球实验检测细胞球直径和数目,极限稀释实验检测5、10、20、50、100、200、500个/孔细胞密度下的细胞球数目。结果在PA37S、PA38S细胞中,CAR-T组、CAR-T+DAPT组EGFRvⅢ蛋白相对表达量均低于对照组、DAPT组,DAPT组、CAR-T+DAPT组Hes1蛋白相对表达量均低于对照组、CAR-T组(P均<0.05)。成球实验结果显示,在PA37S、PA38S细胞中,DAPT组、CAR-T组、CAR-T+DAPT组细胞球数量和直径均低于对照组,以CAR-T+DAPT组降低更明显(P均<0.05)。极限稀释实验结果显示,在PA37S细胞和PA38S细胞中,5、10个/孔细胞密度下各组细胞球数量比较差异均无统计学意义(P均>0.05);20个/孔细胞密度下CAR-T+DAPT组细胞球数量低于对照组,50、100、200个/孔细胞密度下CAR-T+DAPT组细胞球数量均低于对照组、DAPT组、CAR-T组,500个/孔细胞密度下DAPT组、CAR-T组、CAR-T+DAPT组细胞球数量均低于对照组且CAR-T+DAPT组降低更明显(P均<0.05)。结论抗EGFRvⅢCAR-T疗法联合DAPT可抑制GICs的自我更新能力。

下调Tim-3对肝癌干细胞自我更新能力及Wnt信号通路的影响

目的探讨Tim-3对肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)自我更新能力及Wnt信号通路的影响.方法培养人肝癌细胞系HepG2、SMMC7721及正常干细胞系L02,流式细胞仪分选Nanog阳性(+)的肝癌干细胞;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Tim-3在3个细胞系中的mRNA表达水平及在肝癌干细胞中的mRNA表达水平;HepG2肝癌干细胞转染Tim-3 siRNA,荧光显微镜和光学显微镜检测转染率,Western blot法检测转染后Tim-3蛋白水平;qRT-PCR检测转染前后Tim-3、Wnt3、β-catenin的mRNA表达水平;细胞克隆形成试验和细胞成球试验检测转染前后HepG2肝癌干细胞的自我更新能力的变化.结果 qRT-PCR检测Tim-3在肝癌细胞系HepG2、SMMC7721中的mRNA表达显著高于正常肝细胞L02(P<0.05);Tim-3在HepG2肝癌干细胞的表达明显高于肝癌细胞(P<0.05);在SMMC7721肝癌干细胞与肝癌细胞比较Tim-3mRNA表达有低趋势;经荧光镜和光学显微镜观察,Tim-3 siRNA转染细胞良好;Western blot法结果表明,Tim-3蛋白水平在siRNA-451组细胞中的表达显著低于siRNA-750、siRNA-NC、未转染细胞(P<0.05);转染后HepG2干细胞Tim-3、Wnt3、β-catenin的mRNA表达水平均显著下降;克隆形成实验和细胞球形成实验显示转染Tim-3 siRNA后,细胞的克隆形成能力和细胞球生长能力均显著降低(P<0.05).结论下调Tim-3表达水平后,可通过抑制Wnt信号通路,最终减弱肝癌干细胞的自我更新能力.

Tim-3对肝癌干细胞自我更新能力的调控以及对TGF-β1/smad4通路的影响

目的:探究T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)在肝癌干细胞自我更新中的调控作用以及对转化生长因子-β1(TGF-β1)/smad4通路的影响。方法:体外培养肝癌细胞Huh7,获取肝癌干细胞,免疫印迹(WB)法检测肝癌干细胞标志物表达,包装si-Tim-3慢病毒载体感染肝癌干细胞分为空白组、si-NC组(添加阴性序列病毒)和si-Tim-3组,CKK-8法检测细胞增殖情况,光镜计数法检测细胞成球率,平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成情况,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室检测细胞侵袭能力,WB法检测细胞中TGF-β1、smad4蛋白表达。结果:与肝癌细胞相比,肝癌干细胞标志物白细胞分化抗原133(CD133)、CD90、上皮细胞黏附分子(Ep CAM)蛋白表达显著升高(P<0.05)。与空白组和si-NC组相比,si-Tim-3组细胞增殖抑制率、迁移抑制率和Smad4蛋白表达显著升高,成球率、克隆形成率、侵袭数量和Tim-3、TGF-β1蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:抑制Tim-3表达后可抑制肝癌干细胞增殖、侵袭、迁移,其机制可能与下调TGF-β1、上调smad4蛋白有关。

紫草素对脑胶质瘤干细胞干性维持的相关研究

目的研究紫草素对脑胶质瘤干细胞(GSCs)干性维持的影响及相关分子机制。方法应用免疫荧光方法对分离提取的细胞球进行干细胞表面标志性分子CD133和nestin的检测;紫草素(2μmol·L-1)处理GSCs 12、24和48 h后,光镜下观察紫草素对GSCs悬浮细胞球形态的影响;采用亚球形成实验评估紫草素对GSCs自我更新能力的影响;应用Western blot方法检测紫草素作用下GSCs干细胞标志分子CD133的表达变化,同时检测紫草素作用下,GSCs中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的表达变化;联合应用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)后检测紫草素作用下,GSCs干性维持的改变。结果分离提取的细胞球表面CD133和nestin呈阳性表达;紫草素能够明显抑制GSCs悬浮细胞球的形态和二代细胞球的形成,同时能够降低CD133的表达;与对照组相比,紫草素作用下,GSCs中PI3K和Akt的表达无变化,pPI3K和p-Akt的表达呈现药物时间依赖性明显下降;此外,IGF-1能够明显改善紫草素对GSCs干性维持的抑制作用。结论紫草素能够明显抑制GSCs的干性维持,其机制可能与PI3K/Akt信号通路有关。

未来输电网架结构

提高大电网自愈能力、优化波动性能源备用、发挥输电设备利用率是未来输电网架结构规划的3个关键问题.首先讨论美国"Grid 2030"直流异步互联电网结构;介绍欧洲"Super Grid 2050"广域可再生能源电网结构;论证中国"三北"可再生能源电网远景设想的必要性和可行性,并给出2020,2030,2050年这3个时间节点的可再生能源电网目标网架;最后探索特高压电网结构应用于超/特高压直流电网的优势.

低氧微环境下胶质瘤干细胞表型的改变与RNA结合蛋白相关

目的研究低氧微环境下胶质瘤干细胞表型变化与RNA结合蛋白表达之间的关系。方法 1%O_2的低氧条件培养胶质瘤干细胞U87MG-SLC和GSC5,20%O_2为常氧对照。分别利用MTS实验和肿瘤球形成实验检测其增殖能力和自我更新能力;Western blot检测干性相关蛋白和RNA结合蛋白表达水平的变化;通过吸光度扫描进行统计分析。结果低氧条件下肿瘤干细胞的增殖能力下降(P<0.05),自我更新能力上升(P<0.05),HIF-1α和干性标志物Nestin和SOX2上调(P<0.01;P<0.05)。与常氧组相比,低氧组胶质瘤干细胞的多种RNA结合蛋白表达水平发生变化:hnRNPF、UNRIP以及Hu D表达水平上调(P<0.05),PCBP2和UNR表达水平下调(P<0.01;P<0.05),而其他RNA结合蛋白(hnRNPK、ADAR1、PCBP1、CIRP、EBP1、e EF1A、PTBP1、PTBP2)表达水平没有显著性变化。结论低氧微环境下,胶质瘤干细胞的表型变化与RNA结合蛋白hnRNPF、UNRIP、Hu D、PCBP2和UNR表达水平相关。

UBE2C调控前列腺癌干细胞样细胞自我更新能力的作用研究

目的探讨泛素偶联酶2C(UBE2C)在前列腺癌干细胞样细胞维持自我更新能力中的调节作用。方法采用磁激活细胞分选测定前列腺癌DU145和C4-2B细胞株中CD44+细胞比例;在DU145-CD44+及C4-2B-CD44+细胞株中转染si-UBE2C^1#、si-UBE2C^2#和si-UBE2C^3#序列,并设转染阴性序列的对照组;采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测3条序列的敲减效率;Western blotting检测转染后UBE2C蛋白的表达水平;QPCR检测细胞干细胞特性相关基因(KLF4、SOX2、Oct4、Myc、NANOG、ABCG2、CTNNB1、UBE2C、ACTB)的表达水平,倍比稀释成球实验检测肿瘤干细胞的成球能力和成球频率,CCK8细胞增殖实验检测肿瘤干细胞对多西他赛的敏感性。结果磁激活细胞分选测定显示,前列腺癌C4-2B和DU145细胞株分选后CD44+细胞比例分别为90.3%和98.3%。QPCR检测显示,在3条si-UBE2C序列转染后,UBE2C的表达水平与对照组比较均显著下降(P<0.01),其中si-UBE2C^1#和si-UBE2C^2#的敲减效率最高,用于后续干细胞特性相关实验。Western blotting检测显示,转染后DU145-CD44+和C4-2B-CD44+细胞株中UBE2C蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)。QPCR检测显示,敲减UBE2C的表达能够显著抑制前列腺癌CD44+干细胞样细胞中干性相关基因Oct4、Myc、NANOG、ABCG2、CTNNB1、UBE2C和ACTB的表达。倍比稀释成球实验显示,在C4-2B-CD44+和DU145-CD44+细胞株中敲减UBE2C表达后,第一代和第二代前列腺癌干细胞样细胞的成球数量显著下降,同时前列腺癌干细胞样细胞的成球频率亦显著下降(P<0.05)。CCK8实验显示,敲减UBE2C表达后,C4-2B-CD44+细胞株中对照组、si-UBE2C^1#组和si-UBE2C^2#组多西他赛的IC50分别为42.3、7.5和3.6 nmol/L,DU145-CD44+细胞株中对照组、si-UBE2C^1#组和si-UBE2C^2#组多西他赛的IC50分别为56.2、11.2和5.0 nmol/L。结论UBE2C在前列腺癌CD44+干细胞样细胞维持干细胞特性中发挥重要作用,有望成为抑制前列腺癌干细胞样细胞的治疗靶点。

基于具有自我更新机制的量子粒子群算法的配电网重构

配电网重构本质上是一个复杂的求解满足一定约束条件下的多目标非线性组合优化问题。针对传统粒子群算法中粒子存在老化并使得算法存在早熟收敛的现象,文中将自我更新机制融入量子粒子群算法,改进了算法的收敛速度和全局搜索能力。并且针对配电网的特性采取了二进制编码,采取了合适方法淘汰不可行解,改善了算法的计算效率。最后通过仿真,验证了所提出的算法在求解重构问题时具有更好的寻优结果,且收敛速度和全局搜索能力均有提升。

微小RNA-202-5p介导瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚族2表达调节三阴性乳腺癌干细胞的自我更新能力的机制

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-202-5p通过瞬时感受器电位离子通道蛋白V亚族2(TRPV2)调节三阴性乳腺癌(TNBC)干细胞的自我更新能力.方法实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测干细胞中的miR-202-5p表达量.RT-qPCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测TRPV2、雌激素相关受体B(Esrrb)、性别决定区Y框蛋白2(Sox2)、八聚体结合转录因子4(Oct4)、以及干细胞表面标志物CD133和CD13的mRNA以及蛋白质的表达.并进一步展开肿瘤干细胞特性获得实验.应用SPSS 21.0统计软件分析.结果 miR-202-5p在TNBC干细胞中低表达(1.00±0.17比0.58±0.20,t=2.771,P<0.05).miR-202-5p mimic+ shTRPV2处理后,Esrrb、Sox2、Oct4、CD133 、CD13的mRNA[Esrrb(1.10±0.09)比(0.39 ±0.04),t=22.800,P<0.05]、Sox2[(1.10±0.08)比(0.41 ±0.06),t =21.820,P<0.05]、Oct4[(1.00 ±0.09)比(0.43 ±0.07),t=15.810,P<0.05]、CD133[(1.01 ±0.09)比(0.41 ±0.07),t=6.640,P<0.05]和CD13[(0.99 ±0.09)比(0.40±0.07),=16.360,P<0.05])和蛋白表达呈降低趋势,细胞成球能力[(1.03±0.06)比(0.43±0.05),t=24.290,P<0.05]、克隆形成能力[(65.00±4.76)比(28.44±3.88),t=18.830,P<0.05]、增殖能力[(18.43 ±1.88)比(9.02±1.22),t=13.280,P<0.05]显著降低;而miR-202-5pinhibitor处理后Esrrb、Sox2、Oct4、CD133 、CD13的mRNA(Esrrb[(1.11 ±0.08)比(2.11±0.16),t=17.680,P <0.05]、Sox2[(1.09 ±0.06)比(2.15 ±0.10),t =28.740,P<0.05]、Oct4[(0.98 ±0.07)比(2.09 ±0.19),t=17.340,P<0.05]、CD133[(1.01±0.07)比(2.22 ±0.10),t=31.350,P<0.05]和CD13[(0.94 ±0.05)比(2.32 ±0.11),t=36.120,P <0.05])和蛋白表达增加,细胞成球能力[(1.47±0.09)比(1.83 ±0.10),t=8.460,P <0.05]、克隆形成能力[(77.23±6.00)比(110.37±11.25),t=8.220,P <0.05]、增殖能力[(20.42±2.04)比(30.68 ±2.82),t =9.320,P <0.05]显著提升.结论 TNBC细胞中的miR-202-5p上调抑制TRPV2基因的表达,抑制TNBC干细胞自我更新能力的获得.

PPZ与5-FU对胃癌细胞生长、自我更新能力的影响及相互作用

目的探讨泮托拉唑(PPZ)、5-氟尿嘧啶(5-FU)在调控胃癌细胞及胃癌干细胞生长、自我更新能力中的影响及其相互作用。方法将SGC-7901和HGC-27细胞分为3组实验:5-Fu处理组、PPZ处理组和5-Fu+PPZ组。通过细胞成球实验检测PPZ加药前后胃癌细胞系(SGC7901、HGC-27)中胃癌细胞及胃癌干细胞自我更新能力的变化,观察PPZ对胃癌细胞系成球能力干扰情况;MTT法检测PPZ、5-FU对胃癌细胞及胃癌干细胞增殖能力的影响,观察PPZ对5-FU药物敏感性的调节作用。结果PPZ加入后胃癌细胞系(SGC7901、HGC-27)和胃癌干细胞系(SGC7901-SP、HGC-27-SP)自我更新率比PPZ加入前的自我更新率下降(P<0.01);PPZ、5-FU对胃癌细胞(SGC7901、HGC-27)增殖均有抑制作用,而5-Fu+PPZ联合组抑制最为明显,抑制增殖的作用在24 h开始出现,96 h最低,均低于0 h。PPZ对胃癌干细胞(SGC7901-SP、HGC-27-SP)增殖均有抑制作用,在48 h逐渐明显;加入PPZ后,胃癌干细胞(SGC7901-SP、HGC-27-SP)两个细胞系酶标仪检测到的吸光值在48 h、72 h、96 h时均下降。72 h和96 h时,加与不加PPZ的吸光值比较,统计学意义显著(P<0.01)。不同浓度(0~50μg/ml)5-FU对胃癌干细胞(SGC7901-SP、HGC-27-SP)增殖抑制的差异不显著;而加入PPZ 100μg/ml后,随着5-FU浓度的增加增殖抑制作用逐渐增强,在40~50μg/ml浓度的5-FU对胃癌干细胞(SGC7901-SP、HGC-27-SP)增殖抑制更加明显;加入PPZ后,40μg/ml及50μg/ml浓度的5-FU作用下胃癌干细胞(SGC7901-SP、HGC-27-SP)酶标仪检测到的吸光值均降低。结论PPZ能有效抑制胃癌细胞及胃癌干细胞的自我更新能力,抑制其增殖,并可提高其对5-FU的化疗敏感性。PPZ有望成为逆转胃癌耐药的一类联合治疗药物应用于临床。

新时代背景下自我更新型教师的要素重构

自我更新型教师强调教师自我专业发展意识和反省认知能力,是目前国内普遍认可和推行的教师专业发展取向,但在新时代的背景下,面对"新方位""新征程""新使命",其内在要素已发生更替或已发生权重位移。基于此,试图结合时代背景并依据斯腾伯格的三元智力理论,从专业国际核心素养的分析力、本土一线教育现代化专业知识的创造力以及专业信息化的实践力三方面出发,对新时代背景下的自我更新型教师进行要素重构,以期切实促进教师队伍建设,助力国家教育现代化,并为之后继续挖掘和探讨自我更新型教师的要素提供思路与借鉴。三大要素之间既各具成分、相对独立,又相互联系、相互渗透,并在实践中共同构成充满时代气息的自我更新型教师。

高表达ANXA2肝癌干细胞外泌体对肝癌细胞恶性生物学特性的调控作用

[目的]探讨肝癌干细胞来源外泌体中差异表达的蛋白质,重点分析外泌体ANXA2分子对肝癌恶性生物学特性(自我更新、侵袭和转移能力)的影响。[方法]采用无血清悬浮培养法和干细胞标志物流式分选术分离人肝癌干细胞;分别采用干细胞球形成实验、体外侵袭转移能力鉴定分离所得肝癌干细胞;采用蛋白质谱分析肝癌干细胞来源外泌体中的差异表达蛋白质;si RNA靶向抑制ANXA2表达后,分别进行肝癌细胞球形成实验、体外侵袭与迁移实验检测外泌体ANXA2对人肝癌细胞自我更新、侵袭、转移能力的影响;收集肝癌患者和正常人血浆,通过凝胶排阻层析联合CD63免疫磁珠分离纯化外泌体,Western blot检测外泌体中ANXA2表达情况,结合临床病理资料,综合分析外泌体ANXA2的临床相关性。[结果]成功分离得到肝癌干细胞CD133+SK-Hep-1,其具有典型的肿瘤干细胞生物学特性。与CD133-SK-Hep-1细胞外泌体相比,CD133+SK-Hep-1肝癌干细胞来源外泌体中具有多种差异表达蛋白,其中外泌体ANXA2表达明显上调。siRNA靶向抑制肝癌干细胞ANXA2表达后,其外泌体中ANXA2表达也下降。分别采用PBS、siRNA靶向抑制肝癌干细胞ANXA2后外泌体(Exo-LCSCs-siANXA2)、肿瘤干细胞来源外泌体(Exo-LCSCs)刺激肝癌细胞系HepG2、SNU398,其自我更新、侵袭和转移能力依次增强。Western blot结果显示,肝癌患者血浆外泌体ANXA2表达明显高于健康人血浆;肝癌患者血浆外泌体ANXA2表达与患者年龄、性别无明显相关性,而与肿瘤TNM分期和转移显著相关。[结论]高表达ANXA2的肝癌干细胞的外泌体对肝癌细胞恶性生物学特性具有调控作用。