A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

羊栖菜多糖抗A型塞内卡病毒感染PK-15细胞活性和机制探究

研究羊栖菜多糖抗A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染PK-15细胞的活性及机制。首先采用水提法提取羊栖菜粗多糖,然后用不同孔径超滤膜将粗多糖分为不同分子量段;通过荧光定量PCR测定不同分子量粗多糖抗SVA活性,采用水提醇沉法将抗SVA活性最高分子量段的粗多糖进行纯化并测定其细胞毒性及抗SVA活性;通过在SVA感染周期不同阶段给药研究纯化多糖的抗SVA机制。结果表明,分子量越大的粗多糖抗SVA活性越强;多糖浓度和SVA浓度均与抗SVA活性呈现量效关系,纯化后的多糖对SVA(MOI=0.1)感染PK-15细胞的治疗指数为412,1 mg/mL的多糖对SVA(MOI=10-1~104)感染PK-15细胞病毒载量的抑制率在90%~99.999%之间;不同给药时间试验结果表明,多糖能在SVA吸附或穿入细胞以及病毒复制过程发挥抗病毒作用,其中抑制SVA吸附或穿入的活性最强。本研究分离纯化得到的羊栖菜多糖有很强的抗SVA活性,可为后续抗SVA药物的研发提供参考。

表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb)5D10(1∶1000)、鼠源Strep-tag II MAb(1∶2000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G(1∶2000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定。IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag II MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-21细胞及阴性对照细胞均无绿色荧光,表明拯救了Strep-tag II标记的重组病毒,并将其命名为r SVA-Strep。将r SVA-Strep在BHK-21细胞中连续传10代,每隔2代采用引物VP1-F/R经PCR鉴定并对第10代重组病毒的VP1基因测序以鉴定r SVA-Strep的遗传稳定性。结果显示,每隔两代的重组病毒经PCR扩增后均出现约780 bp的目的条带,第10代重组病毒扩增的VP1基因测序结果显示Strep-tag II基因仍在重组病毒中,且无基因突变,表明r SVA-Strep的遗传稳定性较强;将SVA-WT和r SVA-Strep分别以MOI 0.01感染BHK-21细胞,在感染后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h收获病毒测定病毒滴度并绘制生长曲线,结果显示在病毒感染36 h内r SVA-Strep和SVA-WT生长动力学基本一致,表明Strep-tag II的引入在病毒感染36 h内对SVA的复制基本无影响。采用0.2%甲醛充分灭活r SVA-Strep,并利用Strep-TactinRXT Purification纯化试剂盒纯化该灭活病毒,将r SVA-Strep灭活病毒上清加至Strep-Tactin亲和层析柱,分别用不同体积洗脱缓冲液依次洗脱病毒并通过western blot鉴定病毒的纯化效果。对纯化过程中不同洗脱液洗脱病毒的western blot结果显示,不同体积的洗脱液中E1、E2和E3均出现VP0和VP2两条带,且E1和E2的条带最明显,表明洗脱缓冲液的最佳洗脱体积约为2.2 CV;以上结果表明r SVA-Strep可通过Strep-Tactin亲和层析柱一步法纯化。本研究在SVA中插入Strep-tag II标签,为SVA灭活疫苗的快速纯化提供技术手段,也为其他病原的快速纯化方法的建立提供参考。

A型塞内卡病毒序列元件与蛋白功能研究进展

A型塞内卡病毒(SVA)是一种引起猪水疱性疾病的新发病毒。该病毒是小RNA病毒科、塞内卡病毒属的唯一成员。SVA基因组为单股、正链、不分节段的线性RNA,其中间为较长的编码区,共编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白;两端分别为5′和3′非编码区,在病毒复制、启动蛋白表达以及影响病毒毒力等过程中起到了重要的作用。SVA的结构蛋白为VP1、VP2、VP3和VP4,主要参与病毒衣壳的形成;非结构蛋白则与病毒复制和免疫逃逸密切相关。作为一种新发病原体,关于SVA分子机制的研究尚未深入。本文系统地总结了SVA基因组结构和功能的研究进展,为SVA的深入研究,尤其是抗病毒制剂的研制提供参考依据。

A型塞内卡病毒VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备A型塞内卡病毒(SVA)VP3蛋白多克隆抗体,采用同源重组技术将SVA VP3基因连接至原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-SVA-VP3。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),以1 mmol/L的IPTG进行诱导表达并纯化表达产物,随后将纯化的VP3重组蛋白皮下多点注射新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot分别对抗体效价、反应性和特异性进行鉴定。结果显示:重组VP3蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36 kDa;制备的VP3蛋白多克隆抗体能与VP3重组蛋白和SVA发生特异性反应,其ELISA效价达1:10000以上,Western blot和IFA效价达1:5000。综上,本研究成功制备了SVA VP3多克隆抗体,其具有较高的效价和特异性,可为后续SVA致病机制及检测方法等研究奠定基础。

基于改进SVA的SAR/INSAR图像处理

针对现有的Spatially Variant Apodization(SVA)算法不能有效抑制旁瓣或损失主瓣能量的问题,本文提出了一种改进的SVA算法.该算法把传统的滤波器从3点扩展到5点,并且根据采样率的不同,设定相应的滤波器参数,得到满足约束优化理论的最优解.该算法适用于任意奈奎斯特采样率,既能有效地抑制旁瓣,又能保持主瓣的能量和信号的高分辨率;同时能够在一定程度上提高图像的信噪比,在干涉操作中增强复图像对的相关性.实验结果表明,与传统的频域加窗方法相比,该方法能够在保持图像高分辨率的前提下,更有效地抑制旁瓣;同时提高干涉操作的精度.

基于SVA一体化的非层状矿体空间构模研究

分析了已有三维数据模型的特点及其优缺点,论证了采用混合数据模型对建立真三维非层状矿体模型的合理性;基于矢量栅格一体化的建模思想,提出了重构非层状矿体的表面-体元一体化的Solid-Volume-ARTP(SVA)数据模型,并设计了相应的概念模型和逻辑模型;以SVA数据模型为基础,抽象出8种几何元素,设计了相应的数据结构.利用VC++和OpenGL语言开发了具有SVA一体化建模等功能的矿体三维可视化系统.以某铁矿为实例,建立了SVA三维数据模型,并对系统进行了验证.

SVA反转录转座子的研究进展

SVA反转录转座子在人类基因组中的拷贝数约2 700个,可通过DNA-RNA-DNA的途径实现反转录转座,SVA插入到基因组中,从而改变基因组的结构和功能。SVA反转录转座子不仅对人类基因组的进化做出了重要贡献,还是多种疾病的重要原因。

基于SVA的步进频率探地雷达距离旁瓣抑制

论文分析了步进频率探地雷达距离旁瓣的产生机理及其影响,对传统的线性加权法抑制距离旁瓣效果进行了对比分析,包括时域加权和频域加权,理论和实验结果表明:线性加权法在抑制距离旁瓣的同时容易造成分辨率下降。因此,本文提出基于SVA的步进频率探地雷达距离旁瓣抑制方法,它是一种非线性加权方法,能对时域波形主瓣和旁瓣自适应地选择加权函数,达到保留主瓣抑制旁瓣的目的。仿真结果表明,该方法可以有效地抑制步进频率探地雷达距离旁瓣,旁瓣抑制比提高20 dB,并且具有频谱外推的效果,主瓣展宽仅为5%,相同条件下,采用Hamming窗线性加权则主瓣展宽为50%。

紧耦合MIMO系统SVA室内衰落信道容量分析

近年来MIMO系统的天线日渐趋于小型化,随之而来的紧耦合效应成为影响信道容量的主要因素。首先介绍了SVA室内衰落信道模型的建模方法,其次给出了天线间的耦合效应产生的原理,最后将耦合效应带入信道模型中,并且分析其在丰富的多径情况下不同天线间距对信道容量的影响。仿真结果显示天线耦合效应会导致信道容量减少,并且天线间距越短,耦合效应对信道容量的影响越大。

美国生涯与技术师范教育改革创新:SVA项目及其启示

技术师范教育是职业教育师资队伍建设的重要基础。由于我国职业教育师资队伍的问题突出,因此,需要大力改革并发展技术师范教育。借鉴美国纽约州生涯与技术师范教育"学徒计划的成功项目"(SVA)的成功经验,反思我国技术师范教育的改革路径:一是要在技术师范教育的入口上加大增量以解决职业教育师资的数量困境;二是要在技术师范教育的过程中优化变革以解决职业教育师资的结构困境;三是要在技术师范教育的出口上严格把关以解决职业教育师资的质量困境。

A型塞内卡病毒HBWH/1/2018株的分离鉴定及全基因组序列测定

为了鉴定湖北省某猪场水疱性疾病的病原,本研究采用RT-PCR、细胞分离培养、间接免疫荧光检测、电镜观察、病毒基因序列测定及分子进化分析的方法对湖北省某猪场采集的具有水疱样病变的猪水疱皮样品进行了病毒的分离和鉴定及全基因组序列的测定。结果表明:成功分离到1株A型塞内卡病毒(SVA),命名为HBWH/1/2018株。该毒株接种BHK-21细胞培养能够引起明显的致细胞病变效应;免疫荧光试验结果为阳性;病毒滴度为10^(9.35) TCID_(50)/0.1mL;该毒株基因组全长7281 bp(不包括Poly A),开放阅读框为6546 bp,编码2181个氨基酸;VP1核苷酸序列的遗传进化分析表明HBWH/1/2018株与HN01/2017株亲缘关系最近(相似性高达99.4%),而与SVA原型毒株SVV-001株的亲缘关系最远(相似性为91.3%)。本研究不仅丰富了SVA的分子流行病学数据,也为进一步研究SVA的致病机理及相关疫苗的研发奠定了基础。

基于SVA的FPGA接口时序验证方法研究

本文介绍一种基于SVA(System Verilog Assertion)的FPGA接口时序验证实现方法,此方法以FPGA接口下级芯片的手册为基础,将手册中接口时序条件转换成SVA断言,并且在验证运行过程中,自动监测接口信号时序以到自动验证FPGA接口时序的目的。

WW505控制器及SVA9电液转换器在小火电汽轮机上的应用

WW505控制器，阀位控制器及SVA9电志换器相配，将指令信号转换成位移信号输出，直接控制油动动滑阀配，将指令信号转换成位移信号输出，直接控制油动机滑阀使油动机产生位移，LVDT反馈信号再使阀位控制器输出负载电压回零，油动机稳定到批令相对应的位置，实践证明了此种控制方式的合理性。

基于SVA算法和时频分析的ISAR成像

研究了时频分析在ISAR成像中的运用,论述了一维SVA算法和改进的二维SVA算法在提高图像分辨率、降低信号自身旁瓣电平方面的优势。在此基础上,提出将两者联合运用到机动目标的逆合成孔径雷达成像中,改善了传统的距离-多普勒算法对机动目标成像的模糊现象。实验结果证明了此方法的正确性和有效性。

MicroRNA-1285及其靶标DDX3X对猪塞内卡病毒感染PK-15细胞的调控作用

[目的]探究MicroRNA-1285(miR-1285)及其靶标DDX3X在猪塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染PK-15细胞中的调控作用。[方法]利用qRT-PCR、双荧光素酶活性及Western blot等方法研究miR-1285和DDX3X对I型干扰素(IFN-β)分泌及RIG-I信号通路的作用,分析miR-1285及DDX3X对SVA 3C蛋白基因表达的影响。[结果]SVA感染PK-15细胞后,miR-1285表达量显著升高,并且miR-1285与DDX3X存在负靶向关系,二者可促进IFN-β转录及蛋白水平的表达。miR-1285通过靶向DDX3X对RIG-I信号通中的MAVS、TRAF3信号分子起调控作用。对于SVA 3C蛋白基因,DDX3X可以显著抑制其转录,并且可以逆转miR-1285所诱导的上调趋势。[结论]SVA感染PK-15细胞后,宿主miR-1285及其靶标DDX3X对IFN-β及病毒3C蛋白的表达具有调控作用,研究结果将为明确miRNAs调控SVA感染的分子机制奠定基础,并为SVA的防控和诊断提供新的科学依据。

猪A型塞内卡毒株CH-01-2015的溶瘤效果

为探究猪A型塞内卡毒株(SVA)CH-01-2015的溶瘤效果,本试验以SVA CH-01-2015为研究对象,在体外通过显微镜观察和细胞活性测定检测该毒株对前列腺癌细胞(PC-3)、非小细胞肺癌细胞(H1299、A549)、子宫内膜癌细胞(Ishikawa)、胶质瘤细胞(U251)和宫颈癌细胞(Hela)共6种肿瘤细胞的杀伤情况,通过病毒复制动力学测定检测SVA CH-01-2015在不同肿瘤细胞中的复制情况;在体内,通过PC-3裸鼠荷瘤试验检测SVA CH-01-2015的溶瘤效果,通过免疫组化和组织病理学染色检测肿瘤组织中病毒的复制以及治疗后肿瘤组织的形态变化。体外试验结果显示,与对照组细胞相比,感染SVA CH-01-2015的PC-3、H1299和Ishikawa肿瘤细胞被显著裂解,而U251、A549和Hela肿瘤细胞形态无显著变化;且与对照组细胞相比,SVA CH-01-2015毒株能极显著杀伤PC-3、H1299和Ishikawa肿瘤细胞(P<0.01),对U251、A549和Hela肿瘤细胞几乎无杀伤作用(P>0.05);以感染复数(MOI)为1的SVA CH-01-2015分别感染6种肿瘤细胞,其在PC-3、H1299和Ishikawa中复制能力极强,在U251和A549中复制能力较弱,在Hela中基本不复制。体内试验结果显示,与对照组相比,静脉单针、瘤内单针和瘤内2针注射10^(8) TCID_(50)/针的SVA CH-01-2015均能极显著抑制PC-3裸鼠移植瘤的生长(P<0.01),且瘤内2针注射的抑制效果更为显著(P<0.01)。结果表明,SVA CH-01-2015能显著杀伤PC-3、H1299和Ishikawa肿瘤细胞,对U251、A549和Hela肿瘤细胞无杀伤作用,且该病毒能抑制体内PC-3裸鼠移植瘤的生长,瘤内2针注射的抑制效果更为显著。

艾法斯推出S系列两款全新产品——SGD数字信号发生器和SVA矢量信号分析仪

2011年12月2日,艾法斯公司在北京希尔顿酒店召开发布会,推出台式射频测量仪表S系列新产品,数字信号发生器SGD和矢量信号分析仪SVA。艾法斯公司大中华区总经理蒋琦、艾法斯公司产品经理Hiren Joshi等人出席了发布会。

基于SVA的AFDX网络MAC IP核功能验证

近年来,机载SoC设计复杂度的不断提升使得集成IP核的应用越来越广泛,如何高效和准确地对IP核进行功能验证成为目前航空领域的实际需求。采用SVA对AFDX网络MAC IP核搭建层次化验证平台,将断言与待测设计的关键点处进行绑定,并在验证平台中插入断言对测试激励的时序性和完整性进行检查,通过覆盖率统计评估验证的完整性。测试结果表明,采用SVA的验证平台可以在需要检查的功能点发生错误时更快、更清晰地定位出错误源,提高了对机载SoC中IP核功能验证的高效性和准确性。

基于断言语言SVA的设计验证方法

基于断言SVA的验证是一种有价值的主流验证技术。断言特别适合于描述时序特性和因果特性。作为Sys-tem Verilog的重要组成部分,SVA提供了丰富的断言指令,能有效地提高验证测试工作的质量和效率。在此,首先介绍断言验证语言SVA,通过与Verilog验证对比,说明SVA在时序特性和因果特性验证上的优势,证明基于断言的验证是SoC设计验证的一种有效方法,能够有效地提高验证效率。