曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)野生及养殖群体的生化特征及其形成机制的研究

采用生化测定法,对野生及养殖曼氏无针乌贼肌肉的生化特征进行研究,并对其可能的产生机制进行探讨。结果表明,就常规生化组分而言,野生与养殖曼氏无针乌贼碳水化合物和粗脂肪含量并无显著差异(P>0.05);而在水分、粗蛋白等含量上则有显著差别(P<0.05),养殖群体含有较高的蛋白和较低的水分含量。就氨基酸组成而言,野生与养殖曼氏无针乌贼均含18种主要氨基酸,但在含量上养殖群体绝大多数氨基酸均显著高于野生群体(P<0.05)。在脂肪酸组成上,养殖群体较野生群体少一种脂肪酸(十五碳酸C15:0),而在含量上绝大部分脂肪酸与野生群体无显著差别(P>0.05)。该结果说明现阶段的人工驯养并未使曼氏无针乌贼品质下降,养殖群体完全可代替野生群体,成为人类理想的保健食品。养殖群体部分生化指标的变化可能与人工驯养条件下的饵料组成的优质化和单一化及生活环境的改变有关。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖习性及其产卵场修复的研究

采用对比分析方法,观察了曼氏无针乌贼的繁殖习性,比较了不同产卵附着物的附卵效果,选择典型产卵场(中街山列岛海区)进行附着物的调查。结果表明,曼氏无针乌贼有较高等复杂的性行为,有显著的求偶、争偶及雌雄搏斗现象,乌贼交配对其它乌贼交配有诱导作用;乌贼对附卵基有严格选择,没有充足适宜的附卵基,不仅使乌贼产卵时间延迟、数量减少,而且易被水流冲散、沉入底部致受精卵大量死亡,是影响乌贼繁衍的重要因素;附卵基附卵效果依次为聚乙烯(PE)绳、聚丙烯(PP)绳、钢筋、竹子、木头,颜色依次为黑色、蓝色、红色、黄色,形状依次为圆柱体、正三棱柱体、正长方体、扁长方体,粗度以直径0.25—0.50cm为宜,此外附卵基间应有适当空隙;目前,中街山列岛海区柳珊瑚(Plexaauraa sp.)生物量为0.15—0.64棵/m2,平均生物量为0.32棵/m2,资源数量趋于恢复,但远不能适应乌贼资源修复需要。增殖放流试验表明,修复乌贼资源的可能性很大,但在加大增殖放流工作的同时,必须尽快开展产卵场生态环境修复尤其是产卵附着物修复工作。

人工养殖曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖生物学特性研究

采用常规生物学方法和统计回归分析,研究了养殖曼氏无针乌贼卵巢成熟系数(GSI)的变化规律和个体生殖力与其主要形态指标之间的相互关系。结果表明,曼氏无针乌贼春苗100日龄时GSI达到最高(12.2%±3.25%),秋苗140日龄时GSI达到最高(13.7%±3.69%)。曼氏无针乌贼秋苗的体质量相对生殖力(FW)极显著高于春苗FW(P<0.01),F、Fa和FL与胴长(ML)、体质量(W)、净体质量(Wn)和卵巢质量(Wo)呈幂函数或指数函数关系(P<0.01)。FW与ML呈线性相关(P<0.01)。GSI只对Fa有影响(P>0.05);生殖力与肥满度(CF)之间呈极显著的负相关(P<0.01)。多元线性逐步回归分析表明,ML是影响曼氏无针乌贼怀卵量的最重要指标。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)副缠卵腺的组织学及超微结构

采用组织学和电镜技术对曼氏无针乌贼的副缠卵腺及腺体细胞进行了研究。结果表明,副缠卵腺由副缠卵腺壁、腺体小管和结缔组织构成。腺体小管由一层上皮细胞排列围成,各个管道之间通过典型的结缔组织复合体连接在一起;结缔组织复合体由肌肉纤维和血管等构成。小管上皮细胞靠近管腔面着生有微绒毛和纤毛,胞质中有大量的球状小泡分泌物,有的球状小泡被囊泡包裹,通过胞吐作用释放到细胞外,并在纤毛摆动的作用下运送出管道外;腺体管道内存在着大量的共生细菌,呈棒状或者杆状;推测其共生细菌来自于乌贼生活水域的"水平传递"。

投喂四种饵料对曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖性能的影响

以双齿围沙蚕、泥鳅、黄鲫、福寿螺4种不同饵料强化培育胴长(6.50±0.20)cm的曼氏无针乌贼,用曼氏无针乌贼肝脏和卵巢的氨基酸与脂肪酸变化、亲体产卵量、卵径、卵子孵化率及其幼体成活率等指标来评价4种饵料对其繁殖性能的影响。结果表明,黄鲫组曼氏无针乌贼肝脏与卵巢中∑EAA、∑SEAA、∑EAA+SEAA、∑NEAA、∑AA含量在第一次卵巢成熟与第二次卵巢成熟时均显著高于其它投喂组(P<0.05)。黄鲫组乌贼肝脏DHA/EPA在第一次卵巢成熟时显著高于其它投喂组,在第二次卵巢成熟时DHA、DHA/EPA、∑n3PUFA、∑n6PUFA、∑n3/n6PUFA都显著高于其它投喂组(P<0.05);该组乌贼第一次卵巢成熟卵巢DHA、∑n3PUFA、∑n6PUFA、∑n3/n6PUFA及在第二次卵巢成熟时卵巢DHA、DHA/EPA、∑n3PUFA、∑n3/n6PUFA均显著高于其它投喂组(P<0.05),该组第二次卵巢成熟时∑n6PUFA百分含量与沙蚕组无显著差异(P>0.05)。产卵量多少顺序为黄鲫组>沙蚕组>泥鳅组>福寿螺组(P<0.05);孵化率高低顺序为黄鲫组>福寿螺组>泥鳅组>沙蚕组(P<0.05);所产卵子平均直径大小顺序为黄鲫组>泥鳅组>沙蚕组>福寿螺组(P<0.05);幼体成活率高低顺序为黄鲫组>泥鳅组>沙蚕组、福寿螺组(P<0.05)。各指标吻合程度高。

浙江近海曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖生物学特性变化研究

采用常规生物学方法和统计回归分析方法,对浙江近海曼氏无针乌贼的繁殖生物学特性进行了研究,比较了不同时期浙江近海曼氏无针乌贼卵巢成熟系数(GSI)、生物学体型及个体生殖力与生物学指标关系。结果表明,浙江近海曼氏无针乌贼GSI在4月份达到最高(9.51%±7.23%),相比20世纪60年代初、80年代初,自然海域曼氏无针乌贼的性腺发育提前,且生殖期延长。20世纪80年代初曼氏无针乌贼的生物学体型、怀卵量及个体生殖力均大于60年代初和自然海域曼氏无针乌贼,同时曼氏无针乌贼在人工养殖条件下生物学体型、怀卵量及个体生殖力增大。浙江近海曼氏无针乌贼的个体生殖力均随着胴长(ML)、体质量(W)、卵巢质量(WO)、GSI这些指标的增大而增大,除体质量相对生殖力(FW)与ML为密切正相关外,个体生殖力与这些指标的关系均达到了极显著水平(P<0.01)。多元线性逐步回归分析表明,WO是影响浙江近海曼氏无针乌贼个体生殖力的最重要指标。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)精子形成的超微结构

采用透射电镜技术,研究了曼氏无针乌贼精子形成的超微结构变化。结果表明,曼氏无针乌贼精细胞形成初期,细胞核圆形,染色质小团块状,线粒体、高尔基体、中心粒等细胞器分散在细胞质中。随后精细胞形态发生了一系列变化:(1)核内染色质凝集经颗粒化、细纤维化及粗纤维化,最终形成高电子密度的均质结构;(2)核形由圆形或椭圆形,变成长椭圆形,再拉长成长柱状纺锤形,核后端侧部内陷形成核后窝,"9+2"轴丝结构由此形成;(3)高尔基囊泡积累电子致密物,融合发育成顶体囊,并逐渐演变成∩形顶体;(4)线粒体逐渐向核后端移动,形成精子尾部中段的线粒体spur。

华南沿海曼氏无针乌贼Sepiella maindroni表型变异研究

采用软体部 (腕式、胴体长与宽等 )测量分析的方法对我国华南沿海曼氏无针乌贼 Sepiel-la maindroni4个自然群体进行了形态学研究 ,结果发现腕式不完全一致。繁殖群体中 ,雌性平均体重明显高于雄性 ,4对腕明显短于对应的雄性腕长。对角质颚的上颚观察和测量的结果为 :头盖长 a、冠部长 b、吻长 c、翼状部长 e以及吻端至翼状部下端的距离 g随体重、胴体长的增长而呈明显的线性增长趋势 ;b/a可以作为一种遗传标记 ,区分不同种群。对莆田、南澳和湛江 3群体的齿舌进行了扫描电镜观察 。

养殖曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)的两性异形及判别模式的建立

两性个体的有效鉴别是曼氏无针乌贼高效繁育及养殖模式(如单性养殖)建立的基础。为研究曼氏无针乌贼主要形态指标及雌雄形态差异,测量了160只F1代曼氏无针乌贼的19项可测量性状及13项标准化性状。采用聚类分析、主成分分析和判别分析方法研究了曼氏无针乌贼同生群两性间的形态差异。结果表明:两性间可测量性状和标准化性状各有10项有显著性差异(P<0.05);对标准化性状经过主成分分析和R-聚类分析均显示曼氏无针乌贼的两性的差异主要集中在辅助交配器官特征,头部特征,捕食器官和肥瘦特征以及体型特征等4个方面。在此基础上,通过逐步判别法从标准化性状中筛选出3项,即左3腕长/胴长、左4腕长/胴长及左触腕长/胴长,建立了雌雄的判别方程:雄性:F1=223.42X3+165.85X4+7.951X5–108.06;雌性:F2=151.48X3+92.71X4+19.19X5–60.38。所建立的判别方程,对样本群体的综合判别率达到95.00%。利用F2代亲体测量数据对判别函数进行识别验证,综合判别率达到85.34%。在判别方程中的3个标准化性状中,左3腕长/胴长和左4腕长/胴长在两性亲体间均存在显著的差异(P<0.05),表明曼氏无针乌贼的雄性在性选择的作用下,交配器官存在显著差异。

周期性饥饿再投喂对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)幼体生长、体组成及氨基酸和脂肪酸的影响

采用持续投喂(对照组C)和周期性饥饿1d再投喂5d(S1F5)、周期性饥饿2d再投喂4d(S2F4)、周期性饥饿3d再投喂3d(S3F3)4种投喂策略,研究了周期性饥饿再投喂对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)幼体(10.16±0.25g)的生长、体组成、氨基酸和脂肪酸的影响。结果表明:S3F3处理组中体重增重率、胴体长增长率及成活率三个指标均分别显著低于对照组C(P<0.05),而S1F5和S2F4处理组三个指标均与对照组C差异不显著(P>0.05)。另外,随着周期性饥饿时间的延长,体组成水分含量呈显著上升趋势(P<0.05),而粗蛋白和粗脂肪含量均呈显著下降趋势(P<0.05),灰分含量变化不显著(P>0.05)。三个处理组中氨基酸总量(T)、必需氨基酸总量(E)均与对照组C差异不显著(P>0.05);EPA、DPA和DHA含量均与对照组C差异不显著(P>0.05)。综合上述结果表明,S1F5和S2F4组的曼氏无针乌贼幼体均出现了完全补偿生长,并且对其营养组成没有影响,建议曼氏无针乌贼幼体的最佳投喂模式为周期性饥饿2d再投喂4d。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)精荚器的结构及精荚形成研究

采用活体解剖和组织切片技术对曼氏无针乌贼精荚器结构及精荚形成过程进行了初步研究。结果表明,曼氏无针乌贼精荚器由输精管、粘液腺、放射导管腺、中被膜腺、外被膜腺、硬腺、终腺等腺体组成,依靠结缔组织相连,并外披被膜形成椭圆形囊状结构;精子经输精管输送到粘液腺内,形成精子团;在放射导管腺内,精荚的放射导管结构和外膜、中膜、内膜及内被膜形成;在中被膜腺中,精荚的中被膜形成;在外被膜腺中,精荚的外被膜形成;通过硬腺和终腺,精荚形成完整结构,通过精荚管后进入精荚囊储存、成熟,供繁殖季节使用。本文还就曼氏无针乌贼在精荚器结构和精荚形成方面的特点进行了探讨。

养殖对曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)群体遗传多样性的影响

采用24条随机引物对曼氏无针乌贼1个野生群体和5代养殖群体共120个个体(每个群体20个个体)进行了RAPD群体遗传多样性分析,共扩增出119个位点,片段大小为400-2800bp,平均每条引物的扩增带数为4.96条。各群体的多态位点数19-24个不等,多态位点比例为13.33%-20.16%,Shannon指数为0.0768-0.1018。6个群体的平均杂合度为0.0825-0.1231,期望杂合度为0.1325-0.1524,平均杂合子偏离指数均为负值,表明存在杂合子缺失的现象。乌贼6个群体遗传分化系数FST值在0.0188-0.2436,其中最大出现在野生群体和第5代养殖群体之间。表明6个群体间遗传分化已基本处于遗传分化中等的范围内,而野生群体和第5代养殖群体之间已接近中等分化的底线。分子方差分析(AMOVA)结果表明,6个群体的遗传变异中有29.34%是由不同群体间的基因差异造成的。而如果将养殖后的5代群体作为一个总的群体,养殖群体内部有19.38%是由群体间的差异造成的。由此可见,养殖后的曼氏无针乌贼群体相比野生群体多样性指数有所降低,且随着养殖时间的增长养殖群体内部开始出现分化。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)脑显微结构及视腺超微结构观察

采用解剖学、组织切片以及电子显微镜技术,对成熟曼氏无针乌贼的脑部形态结构进行观察。结果表明,以贯穿脑的食道作为参照物,可将其脑分为三部分:食道上神经团、食道下神经团以及位于脑两侧两个发达的视叶,各个神经团又可以细分为不同的神经叶。同时采用光镜和电镜技术对内分泌器官——视腺做了显微结构和超显微结构的观察,结果发现,视腺外缘有结缔组织包裹,位于视神经束区上,嗅叶和背外侧叶之间,视腺内可观察到大量分泌细胞,细胞核较大,直径可达10μm;分泌细胞含有丰富的粗面内质网、高尔基体及很多高电子密度的分泌颗粒。此项研究结果将为进一步研究曼氏无针乌贼的神经结构的生理以及发育提供形态学基础。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)ISSR体系优化及养殖群体遗传多样性分析

采用ISSR-PCR技术对曼氏无针乌贼基因组DNA进行扩增,筛选分析了ISSR-PCR扩增时的主要影响因子,包括Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及退火温度,并用8条ISSR引物对舟山养殖群体进行了遗传多样性分析,最终确立的适用于曼氏无针乌贼ISSR扩增的25?l反应体系为:Mg2+1.5mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,引物0.15?mol/L,dNTPs2.0mmol/L,退火温度为52.2℃。结果表明,扩增得到70个清晰的扩增位点,其中多态性位点60个,多态位点率为85.71%,Nei's基因多样性为0.3105±0.1760,Shannon's多样性指数为0.4610±0.2397。本研究结果表明,舟山曼氏无针乌贼养殖群体遗传多样性较丰富,因此舟山曼氏无针乌贼养殖群体可能有比较高的适应生存的能力,蕴藏着比较大的进化潜能及比较丰富的育种潜力。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)ALSM基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术分离、克隆得到曼氏无针乌贼肝脏ALSM(Astacin-like squid metalloprotease)基因。序列分析表明,ALSM cDNA序列全长1418bp,其包括53bp的5’端非翻译区,1290bp阅读框以及含有poly(A)信号AATAAA的75bp3’端非翻译区,阅读框编码429个氨基酸残基。推导蛋白的相对分子质量为48916.31Da,等电点为7.978。ALSM氨基酸序列的同源性分析显示,不同进化地位动物的ALSM氨基酸序列都具有较高的同源性。系统发生树分析发现,曼氏无针乌贼ALSM首先与金乌贼、莱氏拟乌贼、长枪乌贼及太平洋褶柔鱼的ALSM-Ⅰ亚型聚类,再与其ALSM-Ⅱ及ALSM-Ⅲ亚型聚类。生物信息学分析表明,ALSM编码的蛋白为一种亲水性的分泌蛋白。这些结果对进一步研究ALSM的结构与功能以及从基因调控角度探索曼氏无针乌贼在养殖条件下生物学特性变化机理具有重要意义。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了曼氏无针乌贼β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为2000bp,由长197bp的5’非翻译区(untranslated region,UTR),669bp的3’非翻译区,和1134bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为42.0kDa,理论等电点为5.16。曼氏无针乌贼β-actin氨基酸序列中Ile12、Ser172、Ser174、Gln223、His227、Ile231、Gly232、Ser320、Glu328、Thr360等10个氨基酸残基具有特异性,以及2个特殊的氨基酸残基位点和2个软体动物特有的氨基酸残基。曼氏无针乌贼β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达97%。NJ法系统进化分析显示曼氏无针乌贼首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)血蓝蛋白酚氧化酶样活性研究和相关功能单元片段的克隆

采用分光光度法对曼氏无针乌贼血蓝蛋白及相关功能单元(FUs)的酚氧化酶活性进行研究,并获得该功能单元的序列信息。结果表明,曼氏无针乌贼血蓝蛋白能氧化左旋多巴和邻苯二酚而不能氧化酪氨酸单酚,说明该血蓝蛋白可能具有酚氧化酶活性,并属于儿茶酚酶类;进一步研究显示,曼氏无针乌贼血蓝蛋白酶解片段FUg的酶活特性显著区别于其它功能单元,并与天然血蓝蛋白的酶活变化相一致,经同源克隆得到FUg可能的蛋白质编码区(CDS)区包含969个核苷酸,编码323个氨基酸,序列比对结果显示,该序列与商乌贼(Sepia officinalis)和水蛸(Octopus dofleini)血蓝蛋白有很高的同源性。

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)促性腺激素释放激素(GnRH)基因的鉴定、特征及成熟期的表达研究

促性腺激素释放激素(GnRH)在脊椎动物的繁殖过程中起着至关重要的作用,同时也存在于许多无脊椎动物中。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆出曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)促性腺激素释放激素(命名为SjGnRH,KP 982885.1)。SjGnRH基因的cDNA全长710 bp,开放阅读框(ORF)为273 bp,编码90个氨基酸,包括一条含有31个氨基酸的信号肽、12个氨基酸的GnRH多肽和44个氨基酸的GnRH相关肽(GAP);SjGnRH与剑尖枪乌贼(Uroteuthis edulis)和真蛸(Octopus vulgaris)的同源性分别为86.7%和73.3%;SjGnRH高度保守的十二肽与剑尖枪乌贼和真蛸的octGnRH相似度达100%,其信号肽的相似性分别为66.7%和54.8%,GAP区的相似性分别为95.5%和77.3%;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,SjGnRH基因在成熟期的表达具有特异性,在脑中表达量最高,且与其他组织差异显著(P<0.05);采用原位杂交技术检测SjGnRH mRNA在脑内的表达模式,结果表明:SjGnRH在食道上神经团、食道下神经团和视叶的不同部位均有表达,暗示SjGnRH可能参与曼氏无针乌贼的生殖调控作用。

光照周期对曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)繁殖、性类固醇激素系统及生长性能的调控作用

养殖条件下的性早熟、个体小型化是影响曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)的养殖效益的重要因素。为探讨养殖条件下曼氏无针乌贼性早熟的可能因素,本文探讨了3种不同光照周期(23D:1L;12D:12L;1D:23L)对其繁殖性能及个体生长的影响。结果表明:光照周期对曼氏无针乌贼的繁殖性能总体影响不大,除长光照周期(1D:23L)下,睾酮(T)、雌二醇(E2)等激素水平有较显著的降低外(P<0.05),光照对乌贼繁殖时间、性腺重及性腺发育指数等指标均无明显影响。但光照周期对曼氏无针乌贼生长却有明显影响,在胴长、体重、瞬时生长率(IGR)及肥满度等生长指标上均呈现出短光照组>中光照组>长光照的趋势。短光照组雌乌贼在体重、瞬时生长率和肥满度,雄乌贼在胴长等指标上,均显著优于长光照组(P<0.05)。该结果表明光照周期可作为影响曼氏无针乌贼生长性能的重要因素,在今后的养殖条件优化中应加以考虑。

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)繁殖期行为谱特征的研究

自然海域中曼氏无针乌贼产卵亲体性成熟提前和小型化现象明显,这可能是一种适应性进化,人工干预背景下曼氏无针乌贼繁殖期行为的动态变化值得关注。2020年4-6月室内采用聚焦个体扫描法和定点连续记录法分别观察和记录了曼氏无针乌贼繁殖期的行为活动,并按其生活习性和行为的生物学功能等进行系统化分类,构建了繁殖期行为谱。结果表明,曼氏无针乌贼繁殖期行为谱主要包括三大类12种行为:(1)游泳行为主要分为前进和后退,繁殖期的雌性多处于静潜水底或静浮水中的状态;(2)捕食行为主要分为发现、定位、捕捉和咀嚼等系列动作,曼氏无针乌贼能够快速感知周围17.0-36.0 cm范围内的饵料,捕捉的有效距离为8.0-22.0 cm,能在2.0-10.0 s内完成对饵料的高效捕获;(3)繁殖行为复杂,主要分为求偶、伴游、交配、产卵等,其中求偶行为体现在雄性对雌性的自我展示、追逐配对和争斗护卫等过程,雄性在争斗护卫和伴游过程中的护雌行为尤为激烈。曼氏无针乌贼交配时采用“头对头”的方式,平均交配持续时间42.9 s。曼氏无针乌贼对产卵附着基有选择性且偏好于最初的附卵物,卵群对雌性产卵行为有诱导和刺激作用,每次产卵到附卵过程平均用时108.6 s。曼氏无针乌贼繁殖期行为谱特征的研究可为后续曼氏无针乌贼行为机制和基于全生活史的资源保护等方面提供理论依据。