Ser/Thr蛋白激酶信号转导系统——抗结核药物筛选的新靶点

最近的研究表明,Ser/Thr蛋白激酶不只存在于真核生物中,而且也存在于结核分枝杆菌体内。它们构成结核分枝杆菌的信号转导系统,与结核分枝杆菌在宿主体内和体外的生存密切相关。因此,这一信号转导系统可能成为研制新型抗结核药物的靶点。本文就Ser/Thr蛋白激酶信号转导系统及相关蛋白激酶的特征与功能进行了综述。

嗜热真菌Thermomyces langinosus编码丝/苏氨酸蛋白激酶部分cDNA的克隆及序列分析(英文)

根据几种丝状真菌保守的氨基酸序列,设计了一组简并性的引物,从嗜热真菌Thermomyceslanginosus中提取总RNA,利用RT-PCR的方法,我们得到了一个1243bp的cDNA的片段。片段回收纯化后连接到pGEM-Teasy载体上,PCR扩增重组质粒证实这个长约1200bp片段已经插到载体上。序列分析发现和裂殖酵母的蛋白激酶dis1非常相似,比较两者3'氨基酸序列发现同源性达28%以上。其推断的氨基酸序列上包含有6个丝/苏氨酸蛋白激酶的保守亚区。这些都表明它编码的基因可能是一个新的丝/苏氨酸蛋白激酶。

草菇丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因的克隆及序列分析

根据担子菌丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因编码的氨基酸序列设计两对简并引物,通过巢式简并PCR方法获得草菇(Volvariella volvacea)丝/苏氨酸蛋白激酶同源基因(vv-stpk1)的保守片段,然后通过基因组步行的方法获得了vv-stpk1全长序列。vv-stpk1全长为2 003 bp,含有8个内含子,长度分别为72、57、53、54、45、50、55和48 bp,可编码522个氨基酸残基的多肽。推定的氨基酸序列与玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、木糖发酵酵母(Pichia stipitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)中与细胞形态发生相关的丝/苏氨酸蛋白激酶Orb6的相似性分别为81%、77%和76%,对VV-STPK1蛋白的系统发生学分析的结果表明,VV-STPK1与Orb6同源蛋白聚在同一进化枝上,这些数据都支持VV-STPK1蛋白为与细胞形态发生相关同源蛋白的推定。

链霉菌真核型丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的研究进展

简要回顾了丝/苏氨酸蛋白激酶在链霉菌中的发现过程,详细介绍了链霉菌中几个研究较为深入的丝/苏氨酸蛋白激酶的功能,同时对天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)和除虫霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680中的丝/苏氨酸蛋白激酶的跨膜种类和蛋白结构域特点作了初步的生物信息学分析。

二苯乙烯苷对AD模型小鼠Tau蛋白Thr205和Ser404位点磷酸化的影响

目的:研究二苯乙烯苷(TSG)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠Tau蛋白Thr205、Ser404位点磷酸化的影响,探索TSG抗AD的可能机制。方法:将APP/PS1/Tau三转基因痴呆(3×Tg-AD)小鼠随机分成模型组、阳性对照组(石杉碱甲,0.15 mg/kg)和TSG低、中、高剂量组(0.033、0.1、0.3 g/kg),每组6只;另取6只C57BL/6J小鼠作为正常对照组。各给药组小鼠灌胃相应药物,模型组和正常对照组小鼠灌胃等体积生理盐水,每天给药1次,连续给药60 d。末次给药结束后,采用免疫荧光染色法检测各组小鼠脑组织中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白(Thr205、Ser404位点)的分布和表达;采用Western blotting法检测各组小鼠脑组织中磷酸化Tau蛋白(Thr205、Ser404位点)的表达水平。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠脑组织中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白(Thr205、Ser404位点)表达增多、容易聚集成团、分布更为广泛,相对表达量均显著升高(P<0.01),且Western blotting结果显示磷酸化Tau蛋白(Thr205、Ser404位点)的表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组和TSG各剂量给药组小鼠脑组织中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白(Thr205、Ser404位点)表达和聚集减少、分布范围变窄,相对表达量均显著降低(P<0.01),且Western blotting结果显示磷酸化Tau蛋白(Thr205、Ser404位点)的表达水平也显著降低(P<0.01);与阳性对照组比较,TSG各剂量给药组小鼠脑组织中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白(Thr205、Ser404位点)的分布情况差别不大,相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05),但Western blotting结果显示TSG中、高剂量组小鼠脑组织中磷酸化Tau蛋白(Thr205位点)的表达水平和TSG各剂量组小鼠脑组织中磷酸化Tau蛋白(Ser404位点)的表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:TSG可能通过下调脑组织中磷酸化Tau蛋白(Thr205、Ser404位点)的表达,从而发挥其对AD模型小鼠的抗痴呆作用。

Arg引入“Ser/Thr”平面对木聚糖酶XynⅡ热稳定性的影响

【目的】为了提高来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的高比活木聚糖酶XynⅡ的热稳定性,对其热稳定性影响因素进行改造。【方法】对木聚糖酶XynⅡ进行同源建模和序列比较,在XynⅡ的"Ser/Thr"平面引入精氨酸的四点诱变和五点诱变,对酶的热稳定性进行改造。【结果】获得的2个突变酶在热稳定性上较野生型酶均有不同程度提高,突变酶ST4、ST5的最适温度分别由原酶的50℃提高为52和55℃。55℃保温15 min,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的20%提高为65%和75%;保温1 h,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的15%提高为50%和65%。【结论】突变酶ST4、ST5在保持了XynⅡ优良性质的基础上,进一步提高了其热稳定性,具有更好的应用价值。

蓝藻真核型蛋白质激酶与信号传导

对最近10年在蓝藻中找到大量编码Ser/Thr基因的研究结果进行了综述,并对这些蛋白质激酶在信号传导中的作用模式做了讨论.

Cantharidin and Its Analogues:Anticancer and Ser/Thr Protein Phosphatase Inhibitory Activities

This paper mainly describes the anticancer activities and Ser/Thr protein phosphatase inhibitory activities of cantharidin and its analogues.

FSHR基因Thr307Ala和Asn680Ser位点多态性与男性不育关系的Meta分析

目的:用Meta分析的方法综合评价FSHR Thr307Ala-Asn680Ser等位基因多态性与男性不育的关联性。方法:检索Pub Med、EMBASE、Web of Science、中国知网和万方等中英文数据库2005至今文献,依据选择标准收集相关病例对照研究数据,应用Stata 11.0软件对符合条件的研究结果进行Meta分析。结果:符合纳入标准的共12篇文献,包含病例组2 893例和对照组3 312例。经综合分析:在3种比较模型(纯合比较模型、杂合比较模型和显性比较模型)中,Thr307Ala(rs6165)位点多态性是男性不育的危险因素,OR值分别为1.26(95%CI:1.03~1.54),P=0.023;1.18(95%CI:1.03~1.36),P=0.018;1.20(95%CI:1.05~1.37),P=0.006)。而Asn680Ser(rs6166)位点多态性在两种比较模型(纯合比较模型和隐性比较模型),是男性不育的危险因素,OR值分别为1.24(95%CI:1.05~1.45),P=0.009;1.20(95%CI=1.04~1.39),P=0.013。分层Meta分析结果则表明,在纯合比较模型中,Thr307Ala和Asn680Ser位点多态性在白种人群中是男性不育的危险因素,OR值分别为1.37(95%CI:1.03~1.82),P=0.003;1.21(95%CI:1.00~1.47),P=0.048。结论:在纯合比较模型中,FSHR Thr307Ala和Asn680Ser位点多态性可能是男性不育发生的影响因素之一。

用BOC－Leu－Ser－Thr－Arg－pNA建立前激肽释放酶活性测定法

作者发现发色底物ＢＯＣ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－ｐＮＡ对激肽释放酶具有良好的敏感性和特异性。它受激肽释放酶作用的Ｋｍ和Ｖｍａｘ。分别为２３５ｐｍｏｌ·Ｌ－１和３３７ｎｍｏｌ（ＰＮＡ）·Ｓ－１·Ｕ－１（ｋＫ）；抑制试验显示，该底物对ＡＴ－Ⅲ和ＬＢＴＩ不敏感，用作激肽释放酶测定的回收率为９７．２％～１０２．ｌ％，ＣＶ值２．３％～４．６％。用它建立了血浆激肽释放酶活性测定法，标准曲线线性甚佳，线性范围６．２５％～３００．０％（激肽释放酶活性）．测得健康人、妊娠妇女、肝功能衰竭病人和晚期癌症病人的血浆前激肽释放酶活性分别为１１３．９％，１４５．７％，４０．０％和９０．０％。作者认为，发色底物ＢＯＣ－Ｌｅｒ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－ｐＮＡ是ＰＫ（ＫＫ）活性测定的良好底物，建立的ＰＫ活性测定法简便、快速、敏感、可靠，实用价值大。

集胞藻6803中丝氨酸/苏氨酸激酶系统发育和功能概述

生物的信号感知与传导过程与生物对外界环境的适应性密不可分。提及信号传导系统,真核生物和原核生物中普遍存在的是双元激酶系统和丝氨酸/苏氨酸激酶系统,且关于这2种信号传导系统的研究已有诸多报道。作为一种典型的原核光合模式生物,集胞藻6803除了具有原核生物的双元信号传导系统之外,还具有由12个基因编码的真核类Ser/Thr激酶系统,根据它们的结构特点可以分为2大类,即PKN2亚家族和ABC1亚家族。编码属于PKN2亚家族的Ser/Thr激酶的基因大多数已有功能研究,而其他属于ABC1亚家族的基因大多数功能未知。对集胞藻6803中12个Ser/Thr蛋白激酶的保守域、基序以及蛋白细胞定位等进行分析,同时选取具有代表性的单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥作为参照对象,通过与水稻(15 ABC1Ks)和拟南芥(17 ABC1Ks)中的ABC1家族的蛋白激酶基因进行序列分析比较,从而对集胞藻6803中12个Ser/Thr蛋白激酶的潜在功能和进化关系进行了讨论分析,将为更全面地理解集胞藻6803中Ser/Thr蛋白激酶参与的信号传导过程提供新的见解和思路。

艾灸对AD大鼠学习记忆、GSK-3β和磷酸化tau蛋白的影响

目的:探讨艾灸防治阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)的作用及其机制。方法:大鼠双侧脑室微量注射STZ造模,术后第10天艾灸组灸"关元""长强""命门""百会",同时西药对照组灌胃盐酸多奈哌齐,治疗30 d后用Morris水迷宫测各组大鼠学习记忆能力,再取材用ELISA法、免疫组织化学、Western blot等检测海马区GSK-3β活性及tau蛋白磷酸化位点(Ser396/Thr231)的含量和表达水平。结果:艾灸组与西药对照组较模型组平均游泳距离百分比上升;与假手术组比较,模型组大鼠海马CA1区椎体细胞形态结构异常,阳性染色深,而艾灸组与西药对照组较模型组形态结构完整,阳性染色浅;除假手术组外,GSK-3β活性及磷酸化tau蛋白Ser396、thr231位点相对表达量均升高,且西药对照组和艾灸组低于模型组。结论:艾灸可部分改善AD大鼠学习记忆,其可能通过抑制海马GSK-3β活性,降低p-tau S396、T231的磷酸化水平起到防治AD的作用,且作用效果与西药盐酸多奈哌齐相同。

RhoA和肌球蛋白轻链在肝纤维化大鼠肝组织中的表达

目的观察Rho/Rho激酶信号转导通路关键信号分子RhoA和磷酸化肌球蛋白轻链[p-MLC(Thr18/Ser19)]在大鼠肝纤维化组织中的表达规律。方法HE及Masson三色染色观察肝病理组织学变化;用Western blot检测RhoA、p-MLC(Thr18/Ser19)蛋白的表达;RT-PCR方法检测RhoAmRNA的表达。结果随着肝纤维化的进展,RhoA、p-MLC(Thr18/Ser19)蛋白表达明显增加,RhoAmRNA基因表达也逐渐加强。RhoA和p-MLC(Thr18/Ser19)分别与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈显著正相关。结论Rho/Rho激酶信号转导通路在肝纤维化形成过程中发生变化。

猪链球菌真核样丝氨酸/苏氨酸激酶stk基因敲除株的构建

目的构建猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)2型强毒株05ZYH33真核样丝氨酸/苏氨酸激酶(eukaryoticlike Ser/Thr kinase,eSTK)stk基因敲除突变株。方法构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr),两侧为stk编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选stk编码基因敲除突变株。结果组合PCR分析和基因测序结果均显示stk编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代,基因敲除突变株△stk构建成功。逆转录PCR(RT-PCR)证实了stk在转录水平上的缺失。对筛选的突变株进行连续传代培养,证实△stk能够保持稳定的壮观霉素抗性表型。结论 stk基因敲除突变株的成功构建,为阐明该基因在猪链球菌致病过程中的作用奠定基础。

大鼠肝纤维化过程中肝组织磷酸化肌球蛋白轻链表达增加

目的观察Rho信号通路信号分子磷酸化肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain,p-MLC)在实验性大鼠肝纤维化组织中的表达规律。方法采用胆总管结扎(BDL)方法建立大鼠肝纤维化模型;分别于手术后1、2、3、4周麻醉动物,假手术组4周麻醉动物,留取肝组织;HE及Masson三色染色观察大鼠肝纤维化的病理组织学变化;用免疫组织化学和Western blot检测p-MLC的表达。结果免疫组织化学显示假手术组p-MLC仅在血管壁呈现弱表达;BDL组随着纤维化发展,血管壁表达增强,并在肝窦周围出现阳性表达细胞。Western blot结果显示随着肝纤维化的进展,p-MLC(Thr18/Ser19)蛋白表达明显增加。p-MLC(Thr18/Ser19)表达分别与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)呈显著正相关。结论肝维化形成过程中Rho信号通路信号分子p-MLC表达增强。

CD151对脐静脉内皮细胞Akt-Ser^(473)位点磷酸化和细胞增殖的影响

目的:研究CD151对脐静脉内皮细胞(HUVEC)丝/苏氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化Akt-Ser473(p-Akt-Ser473)表达和细胞增殖的影响。方法:通过构建pAAV-CD151质粒并转染HUVEC,HUVEC分为正常对照组、绿色荧光蛋白(GFP)组和CD151组。Western Blot检测CD151及Akt、p-Akt-Ser473表达,MTT法测定脐静脉内皮细胞的增殖能力。结果:①CD151组CD151及p-Akt-Ser473表达明显增加,CD151组与正常对照组和GFP组比较有显著性差异(P<0.05),而总Akt三组间无明显差异(P>0.05)。②MTT法检测正常对照组、pAAV-GFP转染组、pAAV-CD151转染组的A值分别为0.1663±0.0095、0.169±0.0085和0.2457±0.0044,pAAV-CD151转染组较pAAV-GFP转染组和正常对照组细胞增殖能力增强,且有显著性差异(P<0.05)。结论:CD151具有促进内皮细胞增殖的作用。CD151可能是通过激活p-Akt-Ser473,增加Akt活力,达到促进细胞增殖的作用。

蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶对细胞周期的调节作用及其与肿瘤关系的研究进展

综述蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的分类及其在细胞生长、分化方面的作用,蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶对细胞周期调节作用及其与肿瘤的关系研究进展。蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂的研究有助于我们了解细胞生长、发育、调控的机制,寻找预防和治疗肿瘤的新途径。

日本血吸虫SjPP基因原核表达蛋白的酶活性

分别以磷酸苏氨酸多肽（K-R-pT-I—R—R）和4-硝基苯基磷基二钠盐（pNPP）为底物，研究原核表达的日本血吸虫丝／苏氨酸蛋白磷酸酶重组蛋白rSjPP的酶活性，检测二价金属阳离子（Mn^2＋、Ni^2＋、Mg^2＋、Ca^2＋）、温度、pH值对rSjPP酶活性的影响。结果显示，rSjPP重组蛋白可以有效地水解磷酸苏氨酸多肽，具有丝／苏氨酸蛋白磷酸酶活性。rSjPP酶活性的最适温度为60℃，最适pH值为8．0。1～4mmol／L Ni^2＋对rSjPP酶活力有促进作用，但Mn^2＋、Mg^2＋、Ca^2＋等阳离子对rSjPP的酶活力影响不大。

人细胞增殖相关激酶plk3基因逆转录病毒载体的构建及对细胞增殖的影响

目的：构建人细胞增殖相关激酶基因plk3的逆转录病毒载体（RV），观察该基因对细胞增殖和细胞周期的影响。方法：将plk3基因亚克隆至pMSCV-puroR载体中，经酶切和测序鉴定，制备高滴度的RV，以流动感染法高效感染，半固体集落培养法测定基因导入率：用嘌呤霉素筛选后，获得K562-plk3-puroR和HL60-plk3-puroR细胞。以野生型细胞和导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞作为对照，用PCR鉴定基因的导入，并测定细胞周期及凋亡率等，研究plk3基因导入对细胞的影响：结果：获得pMSCV—plk3-puroR质粒并经酶切和测序证实。对K562和HL60细胞的基因导入率，分别达82．3％±3．70%和62．9％±4．94％（n=3）。经嘌呤霉素筛选后，转基因细胞的阳性率〉99％。K562-plk3-puroR和HL-60-plk3-puroR转基因细胞的增殖曲线比对照细胞降低（P〈0．01）；而导入空载体的K562-puroR和HL60-puroR细胞的增殖曲线与野生型细胞相比较无显著差异．与K562细胞相比较，常规培养时，处于G0～G1期的K562-plk3-puroR细胞增多[（49．7±3．38）％vs（43．9±2．34）％，P=0．03]．以无血清培养堆培养10h后，进入S期的K562-plk3-puroR细胞减少[（43．6±3．74）％vs（54．5±1．52）％，P=0．02]，凋亡率降低[（1．3±0．31）％vs（3．4±0．37）％，P=0．01]，结论：构建了plk3基因的逆转录病毒载体，发现plk3基因的导入叮延缓细胞增殖，并抑制细胞进入增殖周期.

CSF－1R部分基因在大肠杆菌中表达、抗融合蛋白血清制备及丝氨酸／苏氨酸磷酸化的初步研究

鼠巨噬细胞集落刺激因子－１受体（ｍＣＳＦ－１Ｒ）部分序列与质粒ｐＧＥＸ－２Ｔ谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）融合，融合蛋白ＧＳＴ－ＣＤ－Ｐｓｔ（胞浆区），ＧＳＴ－ＣＴｅｒｍ（Ｃ－末端）和ＧＳＴ－ＫＩ（激酶插入区）成功地在大肠杆菌ＪＭ１０９株表达。初步结果指出：（１）ＧＳＴ－融合蛋白在体外激酶分析中可以作为底物；（２）由ＰＫＡ导致的磷酸化可能具有生理学意义；（３）ｍＣＳＦ－１Ｒ被ＣＫＩＩ磷酸化。３２Ｐ标记ＧＳＴ－ＣＤ－Ｐｓｔ的磷酸氨基酸分析证实，ｍＣＳＦ－１Ｒ的胞浆区丝氨酸上被磷酸化，已制备抗ＧＳＴ－ＣＴｅｒｍ，ＧＳＴ－ＫＩ和ＧＳＴ－ＣＤ－Ｐｓｔ兔抗体。抗血清的筛选通过野生型３２Ｄ－ＣＳＦ－１Ｒ转染子免疫沉淀进行。