Ser473-Akt磷酸化介导阿托伐他汀保护大鼠脑缺血再灌注损伤

目的探讨Akt之Ser473位点(Ser473-Akt)磷酸化在阿托伐他汀保护大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法 40只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分成正常组(n=10)、假手术组(n=10)、缺血再灌注(I/R)组(n=10)和干预组(n=10)。采用线栓法制作大鼠脑缺血2 h再灌注72 h模型。正常组和假手术组不做任何处理,I/R组仅生理盐水灌胃,干预组在再灌注后大鼠苏醒时、24 h、48 h分别予生理盐水配制的阿托伐他汀10 mg/kg灌胃。72 h时处死所有大鼠,留取脑标本分别行HE染色及TUNEL染色,Western blotting检测脑前额叶皮质Akt及其Ser473-Akt表达。结果缺血再灌注72 h后,干预组神经细胞形态学变化较I/R组减轻;干预组凋亡阳性细胞数显著少于I/R组(t=-6.014,P<0.001);I/R组前额叶皮质Ser473-Akt较正常组和假手术组显著增加(t>20.327,P<0.001),而干预组明显高于I/R组(t=3.649,P=0.007)。结论 Ser473-Akt磷酸化在阿托伐他汀的神经细胞保护中起重要作用,通过抑制凋亡减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。

葛根素对大鼠脑缺血再灌注侧皮质区细胞凋亡及p-Akt (Ser473)表达的影响

目的观察葛根素(Pue)对大鼠脑缺血再灌注缺血半暗带侧皮质区神经细胞凋亡及p-Akt(Ser473)表达的影响,进一步探讨Pue的神经保护机制。方法 48只实验大鼠随机分为4组:假手术组、缺血再灌注组、Pue组及Pue+LY组。应用栓线法建立大鼠脑缺血再灌注模型,Pue组及Pue+LY组分别予Pue及Pue+特异性PI3K激酶抑制剂LY294002进行干预。于缺血1h再灌注24h行神经功能缺损评分,TTC染色测量梗死面积,Tunel法检测细胞凋亡数目,免疫组化检测p-Akt(Ser473)表达,并进行图像分析。结果 Pue组较缺血再灌注组神经功能缺损评分明显降低(P<0.05),凋亡细胞数显著下降(P<0.05),p-Akt(Ser473)表达显著升高(P<0.05);Pue+LY组较Pue组神经功能缺损评分明显升高(P<0.05),凋亡细胞数显著增加(P<0.05),p-Akt(Ser473)表达显著降低(P<0.05)。结论激活PI3K/Akt信号通路可能是Pue减少神经细胞凋亡、起到神经保护作用的机制之一。

葛根素对大鼠脑缺血再灌注侧皮质区细胞凋亡及p-Akt(Ser473)表达的影响

目的观察葛根素(Pue)对大鼠脑缺血再灌注(IR)缺血半暗带侧皮质区神经细胞凋亡及p-Akt(Ser473)表达的影响,并以特异性PI3K激酶抑制剂LY294002进行比较,进一步探讨Pue的神经保护机制。方法应用栓线法建立大鼠脑IR模型,48只实验大鼠随机分为四组:假手术组、IR组、Pue组及Pue+LY组。于缺血1 h再灌注24 h行神经功能评分,TTC染色测梗死面积,TUNEL法检测细胞凋亡数目,免疫组化检测pAkt(Ser473)表达,并进行图像分析。结果 Pue组神经功能评分比IR组显著改善(P<0.05),凋亡细胞数也显著下降(P<0.05),p-Akt(Ser473)表达显著升高(P<0.05);Pue+LY组神经功能评分较Pue组明显加重(P<0.05),凋亡细胞数也显著增高(P<0.05),p-Akt(Ser473)表达显著降低(P<0.05)。结论激活PI3K/Akt信号通路可能是Pue减少神经细胞凋亡、起到神经保护作用的机制之一。

同型半胱氨酸对葡萄糖代谢和骨骼肌p-Akt(Ser-473)的影响

目的在高同型半胱氨酸血症中,探讨同型半胱氨酸对葡萄糖代谢和骨骼肌组织PI3K/Akt胰岛素信号通路中p-Akt(Ser-473)的影响,揭示同型半胱氨酸诱导葡萄糖代谢异常的机理.方法 40只小鼠随机分为空腹正常对照组、空腹高同型半胱氨酸血症组、进食正常对照组和进食高同型半胱氨酸血症组,每组10只;空腹高同型半胱氨酸血症组和进食高同型半胱氨酸血症组用含1.5%的甲硫氨酸饮水3个月.3个月后,各组取血分别测定同型半胱氨酸、葡萄糖、胰岛素,计算胰岛素敏感指数;利用Western blot检测p-Akt(Ser-473)的改变.结果空腹高同型半胱氨酸血症组与空腹正常对照组、进食高同型半胱氨酸血症组与进食正常对照组比较葡萄糖和胰岛素增加(P<0.05),胰岛素敏感指数降低(P<0.05),p-Akt(Ser-473)蛋白下调(P<0.05),Akt无明显变化.结论同型半胱氨酸可诱导葡萄糖代谢异常,这可能与骨骼肌组织PI3K/Akt胰岛素信号通路的p-Akt(Ser-473)降低有关.

bFGF对大鼠脑缺血再灌注侧皮质区细胞凋亡及p-Akt(Ser473)表达的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠脑缺血再灌注缺血半暗带侧皮质区p-Akt(Ser473)表达的影响,进一步探讨bFGF的神经保护机制。方法应用栓线法建立大鼠脑缺血再灌注模型,36只实验大鼠随机分为3组:假手术组、缺血再灌注组和bFGF组,于缺血1 h再灌注24 h行神经功能评分,TTC染色测梗死面积,TUNEL法检测细胞凋亡数目,免疫组化检测Akt表达,并进行图像分析。结果缺血再灌注组及bF-GF组的神经功能评分分别为(3.18±0.65)分、(2.23±0.59)分,两组比较差异有显著性(P<0.05);假手术组、缺血再灌注组及bFGF组凋亡细胞数目分别为0.91±0.65、17.28±1.01及13.22±1.35,bFGF组的凋亡细胞数目较缺血再灌注组明显减少(P<0.05);假手术组、缺血再灌注组及bFGF组p-Akt(Ser473)表达量分别为94.12±5.27、106.12±2.02及97.28±5.01,与假手术组比较,缺血再灌注组p-Akt(Ser473)表达减少,bFGF组p-Akt(Ser473)表达量显著高于缺血再灌注组(P<0.05)。结论 bFGF的神经保护作用可能与其上调p-Akt(Ser473)表达水平有关。

复方胃痛胶囊靶向磷酸化AKT1抑制前列腺癌生长

靶向AKT1抗癌药物的研发在多种癌症中被报道,但中药复方靶向AKT1的相关研究较少。本研究探讨了一种治疗胃病中药配方——复方胃痛胶囊,通过靶向AKT1在体内外发挥抗前列腺癌生长的作用。通过质谱、靶点预测及生物信息学分析发现,复方胃痛胶囊主要成分中有37种化合物成分具有抗癌活性,木兰花碱[(+)-Magnoflorine]、7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin)等6种成分可能是其抗前列腺癌的主要活性成分。MTT、ROS、细胞凋亡及细胞周期结果显示,复方胃痛胶囊对前列腺癌细胞具有显著的体外抑制作用(P<0.01),80μg/mL浓度下PC3细胞生长抑制率达35%左右,上调ROS产生,并显著促进细胞凋亡(P<0.01)及G 2/M期阻滞(P<0.01)。体内研究结果证实,该药物对皮下前列腺癌肿瘤形成有显著抑制作用(P<0.01)。PPI网络互作、生物信息学分析显示,AKT1、CCND1、ERS1、EGFR等靶点可能发挥核心作用。分子对接及细胞热稳定性结果证实,磷酸化的AKT是复方胃痛胶囊的作用靶点之一(P<0.01),且复方胃痛胶囊显著抑制pAKT(Ser473)表达。本研究证实,复方胃痛胶囊能在体内外抗前列腺癌生长,且可能通过靶向抑制pAKT(Ser473)发挥作用,并探讨了中药复方靶向AKT1治疗前列腺癌的可能性。

中药复方糖耐康干预KKAy小鼠胰岛素信号转导受体后通路作用机制研究

目的观察中药复方糖耐康对自发性2型糖尿病KKAy小鼠胰岛素信号转导受体后通路的影响。方法将KKAy小鼠40只采用随机数字表法分为模型组、糖耐康高剂量组、糖耐康低剂量组、吡格列酮组各10只,另取10只C57bl/6J小鼠作为正常对照组。各药物组灌胃相应剂量药物,正常对照组及模型组灌胃无菌水,连续给药60天。给药期间每周测量小鼠随机血糖、饮水量及体重变化,60天后测定小鼠空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FIns),计算胰岛素敏感指数(ISI),Western blot法测定小鼠骨骼肌和脂肪组织中蛋白激酶B(PKB/Akt1αSer 473)磷酸化、糖元合成激酶3β(GSK-3β)蛋白的表达。结果随给药时间的延长,糖耐康对多饮症状的改善逐渐明显,对体重无明显影响。糖耐康高剂量组FPG、FIns、ISI水平均较模型组显著降低(P<0.05),PKB/Akt1αSer 473蛋白磷酸化水平较模型组明显升高(P<0.05),GSK-3β蛋白表达较模型组明显下降(P<0.05)。结论调节胰岛素信号转导受体后途径中PKB/Akt1αSer 473磷酸化、GSK-3β蛋白表达,可能是中药复方糖耐康改善胰岛素抵抗状态的作用机制之一。

齐墩果酸对HL-60细胞AKT磷酸化的影响

目的研究齐墩果酸(Oleanolic Acid,OA)对人类急性粒细胞性白血病肿瘤细胞HL-60增殖、凋亡的影响及其发挥作用的机制,并分析OA能否抑制PI3K/AKT通路中AKT蛋白的磷酸化。方法以人HL-60细胞作为研究对象,设立对照组与实验组,对照组不加OA,而实验组加入浓度80μmol/L的OA后,利用CCK-8法检测两组细胞增殖情况、流式细胞仪检测细胞凋亡、Western Blot法检测P110α、AKT、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)、mTOR蛋白的表达。结果OA能够抑制HL-60细胞增殖,促进HL-60细胞凋亡,并能下调P110a、p-AKT(Ser473)、p-AKT(Thr308)的表达。结论OA能够抑制HL-60细胞增殖并促进细胞凋亡,并可能通过抑制PI3K/AKT通路中的AKT Ser473及Thr308位点的磷酸化来发挥此作用。

bFGF对大鼠脑出血病灶周边脑组织细胞凋亡的影响及机制初探

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibreglass growth factor,bFGF)对大鼠脑出血周边脑组织神经细胞凋亡的影响,并进行相关机制的初步探讨,为进一步深入了解bFGF对脑出血后神经细胞的保护机制的研究奠定基础。方法:通过脑内定位注射胶原酶,建立大鼠脑出血模型;使用假手术组和出血模型组作为对照,采用Zea Longa 5分制评分法对术后大鼠神经功能进行评价,出血模型建立成功的大鼠又分为对照组和bFGF治疗组,bFGF治疗组按8 ug/kg剂量肌内注射;各组分别于术给药后48小时取血肿旁大脑皮质,TUNEL法检测细胞凋亡数目,免疫组化检测p-AKT表达,并对结果进行统计分析。结果:大鼠脑出血模型构建成功;bFGF治疗组与对照组相比,Zea Longa评分显著降低,血肿旁大脑皮质凋亡细胞数量减少,p-AKT表达增高(P<0.05)。结论:bFGF对大鼠脑出血后周边脑组织具有保护作用,其可能机制是通过提高大鼠脑出血周边脑组织p-AKT的表达来减少神经细胞凋亡数量,从而对脑出血后脑损伤具有保护作用实现。

电针对糖尿病小鼠骨骼肌磷酸化蛋白激酶B、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3蛋白表达的影响

目的:探讨电针对糖尿病小鼠骨骼肌天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)、磷酸化蛋白激酶B(pAkt)的影响,为针灸在临床上治疗糖尿病骨骼肌病变提供实验依据。方法:将18只C 57小鼠随机分为对照组、模型组和电针组,每组6只。注射链脲佐菌素建立糖尿病模型。电针组电针"足三里""阳陵泉"穴,连续波,频率20～30Hz,强度1mA,每次20min,每日1次,连续14d。取比目鱼肌、跖肌、腓肠肌、趾长伸肌和胫骨前肌分别进行肌肉湿重比较,采用Western blot方法检测pAkt(ser 473)、pAkt(Thr 308)、总Akt、caspase-3的蛋白表达。结果:与对照组相比,造模后5条肌肉湿重明显减轻(P<0.01),而电针组与模型组相比可增加肌肉湿重(P<0.05,P<0.01)。总Akt 3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。pAkt(Thr 308)的表达模型组较对照组明显下调(P<0.01),pAkt(ser 473)模型组与对照组相比差异不明显(P>0.05),而电针治疗较模型组表达上调(P<0.01)。与对照组相比,模型组caspase-3明显增高(P<0.01),而电针组与模型组相比能明显下调caspase-3的表达(P<0.01)。结论:电针能够对糖尿病小鼠骨骼肌病变发挥治疗作用,其机制部分是通过促进pAkt(ser 473)/pAkt(Thr 308)、抑制caspase-3的表达实现的。

PHLPP2基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及对舌癌细胞Tca8113增殖的影响

目的构建稳定表达PHLPP2小发夹RNA(shRNA)的Tca8113细胞系,研究敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化水平和Tca8113细胞生长的影响。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成针对PHLPP2基因的shRNA,并将其克隆到shRNA表达载体PSIH-H1上。经测序成功后,包装病毒并感染舌癌细胞Tca8113,建立敲低PHLPP2的稳定细胞株。通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹实验检测RNAi的干扰效果。利用Western印迹实验和细胞生长曲线检测敲低PHLPP2对Akt Ser473磷酸化及细胞生长的影响。结果经测序证明,成功构建PHLPP2 shRNA真核表达载体。qRT-PCR和Western印迹实验证明,构建的shRNA能有效抑制PHLPP2的表达,并构建敲低PHLPP2基因的Tca8113稳定细胞系。实验表明,敲低PHLPP2可促进细胞的生长并升高Akt Ser473的磷酸化水平。结论成功构建PHLPP2基因的shRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制PHLPP2基因的表达,且能升高Akt Ser473的磷酸化水平并促进细胞的生长,为进一步研究PHLPP2在舌癌中的功能及机制奠定了基础。

高糖对肾小管上皮细胞PTEN蛋白表达影响

目的观察高糖条件下肾小管上皮细胞第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)蛋白的表达变化,探讨其在肾小管纤维化病变中的作用及可能机制。方法体外培养大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E),随机分为对照组和高糖组,每组分别设2、12、24、48 h 4个时间点进行动态观察;采用免疫荧光细胞化学染色检测E-钙黏素(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化,Western blotting检测各组PTEN、磷酸化蛋白激酶B[p-Akt1(Ser473)]、E-caderin和α-SMA蛋白表达变化。结果与对照组比较,高糖组培养24、48 h时,PTEN、E-caherin蛋白表达量[分别为(1.15±0.13)、(1.10±0.13)和(1.23±0.11)、(1.22±0.11)]均减少(均P<0.05),而p-Akt1(Ser473)、α-SMA蛋白表达量[分别为(1.53±0.13)、(1.60±0.13)和(1.86±0.10)、(1.91±0.10)]均增多(均P<0.05);PTEN与E-cadherin蛋白表达量呈正相关(r=0.58,P<0.05),与α-SMA蛋白表达量呈负相关(r=-0.61,P<0.05)。结论高糖培养的肾小管上皮细胞中PTEN蛋白表达明显减少,可能通过PI3K/Akt信号通路参与了肾小管纤维化病变的发生发展过程。

脂质体转染质粒DNA成功导入小鼠受精卵

目的研究脂质体转染方法将质粒DNA导入小鼠受精卵中的可行性。方法用免疫细胞化学方法在受精卵内检测pAkt(Ser473)蛋白的分布。用脂质体转染的方法将质粒FLAG-PIPP或FLAGvector导入受精卵,再用Western Blot检测两组卵细胞中pAkt(Ser473)的表达量。用荧光显微镜检测GFP-PH/ARNO质粒在卵细胞中的表达同时观察胰岛素对其影响。结果 pAkt(Ser473)抗体成功穿过透明带表达在受精卵内,细胞膜表达最强。与FLAGvector转染的受精卵相比,pAkt(Ser473)在转染FLAG-PIPP质粒的受精卵内表达量明显减少。与PIP3结合的GFP-PH/ARNO绿色荧光以细胞核表达为主,并且胰岛素可以使荧光增强。结论脂质体转染方法可成功地将质粒DNA穿过透明带导入小鼠受精卵内。

FLAG-PIPP^(H557A)在小鼠1-细胞期受精卵中对PKB/Akt表达的调节作用

目的:研究富含脯氨酸的肌醇多磷酸5-磷酸酶(proline-rich inositol polyphosphate 5-phosphatase,PIPP)在组氨酸557位点突变为丙氨酸(FLAG-PIPPH557A)时对小鼠受精卵中磷酸化苏氨酸蛋白激酶(pAkt)的影响。方法:将FLAG-PIPPH557A、FLAG-PIPP以及FLAG vector重组质粒转染到小鼠受精卵,用蛋白印记、免疫荧光染色以及活性检测方法分析FLAG-PIPPH557A对小鼠受精卵中丝氨酸(Ser)473位点磷酸化的苏氨酸蛋白激酶(pAkt Ser473)表达、定位以及活性的影响。结果:FLAG-PIPPH557A在小鼠受精卵中对pAkt Ser473的表达和活性的调节作用明显低于FLAG-PIPP的作用,两者间有显著差异(P<0.001);而且在小鼠受精卵中FLAG-PIPPH557A不能调节pAktSer473在细胞膜的定位。结论:PIPPH557A在小鼠1-细胞期受精卵中可以通过改变PIPP的活性,影响pAkt Ser473的表达、定位以及活性。

Akt信号通路在紫绀型先天性心脏病患儿心肌慢性缺氧适应中的作用

目的:探讨Akt信号通路在紫绀型先天性心脏病患儿心肌慢性缺氧适应中的意义。方法:收集紫绀型和非紫绀型先天性心脏病患儿共50例,其中紫绀型26例(紫绀组),动脉血氧饱和度(SaO2)60%～89%;非紫绀型24例(非紫绀组),SaO2>95%,均不伴肺动脉高压[肺动脉收缩压<30mmHg(1mmHg=0.133kPa)]。心脏外科手术体外循环前留取右心耳组织,应用Western blot方法检测心肌组织蛋白激酶B(总Akt)和磷酸化蛋白激酶B(Ser473P-Akt)表达水平,免疫组织化学技术检测心肌组织总Akt和Ser473 P-Akt蛋白表达部位与水平。结果:与非紫绀组相比,紫绀组患儿心肌组织Ser473P-Akt蛋白表达水平明显增高(P<0.01),而2组患儿总Akt蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。紫绀组患儿心肌组织Ser473P-Akt蛋白大部分表达在心肌细胞的胞质,胞核亦有微弱表达,而非紫绀组心肌细胞则无明显Ser473P-Akt蛋白表达。2组患儿总Akt蛋白绝大部分也表达在心肌细胞的胞质,胞核亦有微弱表达,但表达部位和水平差异无统计学意义。紫绀组患儿心肌组织Ser473 P-Akt蛋白表达水平与患儿术前SaO2呈负相关(r=-0.771,P<0.01)。结论:Akt信号通路激活可能是紫绀型先天性心脏病患儿心肌慢性缺氧适应的重要信号调控机制之一。

PI3K/AKT及其相关因子在结肠癌中的表达

目的探讨PI3K/AKT信号通路中相关细胞因子PI3Kp110α、p-AKTser473、p-m TORser2448、Cyclin D1在结肠癌组织中的表达及其与临床各病理参数之间的关系。方法采用免疫组织化学法检测65例结肠癌组织(结肠癌组)和15例结肠腺瘤组织(结肠腺瘤组)的PI3Kp110α、p-AKTser473、p-m TORser2448、Cyclin D1的表达,分析各指标在结肠癌组的表达与临床各病理参数之间的关系。结果PI3Kp110α、p-AKTser473、p-m TORser2448、Cyclin D1在结肠癌组中的阳性表达率均显著高于结肠腺瘤组,差异均有统计学意义(P<0.05)。PI3Kp110α、p-AKTser473、p-m TORser2448在结肠癌组的表达与性别、年龄、分化程度、是否淋巴结转移及TNM分期之间差异无统计学意义(P>0.05)。Cyclin D1在不同分化程度及不同TNM分期的结肠癌组织中的表达有统计学差异(P<0.05),在不同性别、年龄及是否有淋巴结转移之间无明显差异(P>0.05)。PI3Kp110α、p-AKTser473、p-m TORser2448、Cyclin D1在结肠腺瘤组的阳性表达与性别、年龄、分化程度、是否淋巴结转移及TNM分期之间无统计学差异(P>0.05)。结论 PI3Kp110α、p-AKTser473、p-m TORser2448、Cyclin D1的表达与结肠癌的发生发展密切相关,对结肠癌的预后评估及新靶点的研发具有重要意义。