抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对MPP+处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及PD特征蛋白表达的影响

目的探讨抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及帕金森病(PD)特征蛋白α-突触核蛋白(α-syn)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法以MPP+、PI3K/Akt激活剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、PI3K/Akt抑制剂LY294002作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,CCK-8检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(AO)染色检测自噬空泡;Western blot检测α-syn、TH、p62、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平。结果MPP+干预显著降低SH-SY5Y细胞存活率,且呈现剂量依赖性(P<0.05)。MPP+和IGF-1处理后SH-SY5Y细胞存活率降低,凋亡率增高(P<0.05);细胞中自噬空泡减少,LC3BⅡ/Ⅰ降低,p62蛋白水平增高(P<0.05);TH蛋白水平降低,α-syn蛋白水平增高(P<0.05);p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt与p-mTOR/mTOR增高(P<0.05)。LY294002对SH-SY5Y细胞的影响与MPP+和IGF-1相反,且LY294002可在一定程度上逆转MPP+对SH-SY5Y细胞的影响(P<0.05)。结论抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可能对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有保护作用。

PI3K/AKT信号通路与PTEN在非小细胞肺癌表达中的相关性

目的研究表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷酸化AKT蛋白(phophorylatedAKT,p-AKT)及PTEN基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome,PTEN)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及意义。方法 采用免疫组织化学Maxvision法检测EGFR、p-AKT及原位杂交法检测PTEN在66例NSCLC和10例正常肺组织中的表达,并分析两者的相关性及其与临床病理特征的关系。结果 EGFR、p-AKT和PTEN在NSCLC中的阳性率分别为69.7%、75.8%、33.3%,在NSCLC中,EGFR的高表达与分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05);p-AKT的高表达与分化程度、淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05)。PTEN在NSCLC中的阳性表达率明显下调,其失表达与分化程度、淋巴结转移、TNM分期和病理类型密切相关(P<0.05)。EGFR与p-AKT表达呈正相关(P<0.05),EGFR与PTEN表达呈负相关(P<0.05),p-AKT与PTEN表达呈负相关(P<0.05)。结论 EGFR和p-AKT在NSCLC的高表达和PTEN基因失表达,可能促进了NSCLC的发生、发展及侵袭转移。可为NSCLC基因靶向治疗提供理论依据。

奇异变形杆菌疫苗候选抗原的鉴定及其免疫保护效果评价

目的 鉴定奇异变形杆菌疫苗候选抗原,并评价其在小鼠体内的免疫保护效果。方法 采用细菌膜蛋白提取试剂盒提取奇异变形杆菌膜蛋白,进行Western blot检测及质谱分析。化学法合成外膜蛋白F(outer membrane protein F,OmpF)及丝氨酸水解酶(serine hydrolase,SH)两种膜蛋白的编码基因,克隆至载体pET-28a,于E.coli BL21(DE3)诱导表达重组蛋白,进行Western blot检测。重组蛋白通过Ni Sepharose High Performance纯化后,经腿部肌内注射15只雌性昆明小鼠,100μg/(0.2 mL·只),共免疫3次,间隔2周。末次免疫后15 d,经眶前静脉窦采血,分离血清,间接ELISA法检测特异性抗体水平;经小鼠腹腔接种致死剂量的奇异变形杆菌,接种1个月,观察小鼠存活情况,并计算抗原的免疫保护率。结果 提取的膜蛋白可与奇异变形杆菌免疫小鼠抗血清发生特异性结合,经质谱鉴定与奇异变形杆菌APB87305(OmpF)、WP_004247605(SH)的同源性为100%。原核表达的重组蛋白OmpF及SH可与奇异变形杆菌免疫小鼠抗血清发生特异性结合,免疫小鼠后均可诱导较高水平的特异性抗体,对致死性奇异变形杆菌感染的保护率分别为100%和86.67%。结论 OmpF和SH是宿主免疫保护性抗原,有望成为制备奇异变形杆菌疫苗的新靶点。

基于结构信息的MHET降解酶挖掘及温和温度下的酶级联塑料降解

聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)的不规范使用和处置造成了严重的生态污染。酶法降解是一种环境友好的解决PET污染的方法。对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯[mono(2-hydroxyethyl)terephthalate,MHET]是PET降解过程中的具有竞争性抑制效果的中间产物,可由MHET降解酶催化水解。本研究采用生物信息学方法,结合序列和结构信息,发现了一种MHET水解酶,BurkMHETase。酶学性质研究表明该酶的最适pH和最适温度分别为7.5和40℃,在pH 7.5−10.0、30−45℃条件下相对稳定;以MHET为底物测定动力学参数kcat为(24.2±0.5)s^(-1),Km为(1.8±0.2)μmol/L,具有与目前最高效的IsMHETase相似的kcat值和更高的底物亲和力。BurkMHETase与PET降解酶IsPETase联用能够改善PET薄膜的降解效果。结构分析和突变实验表明,BurkMHETase可能已经进化出特定的结构特征来催化MHET的水解。对于MHET降解酶,在495位为芳香族氨基酸以及活性部位或远端氨基酸间的协同相互作用对于MHET水解活性似乎是必需的。因此,BurkMHETase有潜力应用于PET双酶降解系统,而所使用的生物信息学方法可以用来高效挖掘新的MHET降解酶。

植物羧酸酯酶的结构、表达调控及生物功能研究进展

羧酸酯酶(carboxylesterase,CXE)是一类广泛存在于动植物及微生物中具有α/β折叠水解酶活性的水解酶类。蛋白序列比对分析表明植物CXE具有一个催化活性的丝氨酸保守结构域(GXSXG基序),结合并水解各种酯类化合物。在植物中,其家族不同成员在组织中的表达存在差异,并受乙烯、病菌等因素的诱导,在除草剂活性物质激活、植物激素信号物质代谢以及生物胁迫等过程中发挥重要的生物学功能。本文对植物CXE家族成员的结构、表达调控和生物学功能进行综述,并讨论了未来可能的研究方向,为CXE功能的深入研究提供参考。