加味丹参饮含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬相关基因Atg5和Beclin1 mRNA表达的影响

目的探讨加味丹参饮含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞自噬及其相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达的影响。方法将体外培养的H9C2心肌细胞随机分为空白血清组(CG)、缺氧/复氧组(HRG)、加味丹参饮含药血清组(JDG)、JDG+自噬抑制剂(3-MA)组(JIG)、JDG+自噬激动剂(RAPA)组(JAG)。倒置显微镜观察各组心肌细胞生长及形态变化;MTT比色法测定心肌细胞存活率;透射电子显微镜观察心肌细胞自噬体形态及数量;实时荧光定量PCR检测自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达。结果与CG比较,HRG镜下心肌细胞变性坏死程度增加,细胞存活率下降(P<0.01),电镜下自噬体增多,实时荧光定量PCR示Atg5、Beclin1 mRNA表达上调;与HRG相比,JDG及JAG镜下心肌细胞变性坏死程度减轻,细胞存活率显著升高(P<0.01),电镜下自噬体增加,Atg5、Beclin1 mRNA表达进一步上调(P<0.05)。结论加味丹参饮预处理通过上调自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达,增强细胞自噬,保护缺氧/复氧损伤H9C2心肌细胞。

自噬基因Beclin1启动子细胞自噬模型的建立

【目的】构建自噬基因Beclin1启动子报告基因细胞自噬模型,为筛选出以Beclin1为靶标的中药提供新的细胞模型。【方法】采用瞬时转染双荧光素酶报告基因测定法,确定最佳转染浓度、时间等条件,及Beclin1基因启动子转录活性细胞自噬模型的建立和验证,观察血清饥饿、过氧化氢氧化损伤及自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素对Beclin1基因启动子转录活性PC12细胞自噬模型的影响。【结果】血清饥饿诱导12 h,Beclin1基因启动子转录活性是体积分数10%血清组的1.8倍,而血清饥饿诱导18、24 h与诱导12 h比较其转录活性无明显变化;300μmol/L过氧化氢诱导9 h,Beclin1基因启动子转录活性是0μmol/L过氧化氢组的1.3倍;雷帕霉素在浓度0.1、1 nmol/L可上调Beclin1基因启动子转录活性,并呈浓度依赖性,而5 nmol/L及更高浓度的雷帕霉素可下调Beclin1基因启动子转录活性。【结论】成功建立用Beclin1基因启动子报告基因检测Beclin1基因启动子转录活性特异性的细胞发生自噬模型,血清饥饿、过氧化氢、自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素可诱导Beclin1基因启动子的转录活性。

血清Beclin1水平与糖尿病病人颈动脉粥样硬化和颈动脉内中膜厚度的相关性

目的探讨血清自噬相关蛋白Beclin1水平与糖尿病病人颈动脉粥样硬化和颈动脉内中膜厚度(CIMT)的相关性。方法前瞻性选取2017年3月至2020年12月于济南市妇幼保健院就诊的126例糖尿病病人为研究对象,就诊时测量病人血清Beclin1水平及CIMT水平,记录病人颈动脉粥样硬化情况,并根据病人血清Beclin1水平的中位数分为高水平组和低水平组;分析血清Beclin1水平与糖尿病颈动脉粥样硬化和CIMT水平的相关性;采用逐步回归评估CIMT的独立危险因子,构建受试者操作特征曲线以确定灵敏度和特异度。结果血清Beclin1水平的中位数为2.16μg/L,根据病人血清Beclin1水平的中位数分为高水平组和低水平组,每组63例。高水平组病人空腹血糖、糖化血红蛋白、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白、CTMT[(5.89±0.95)mm比(7.46±1.10)mm]、颈动脉粥样硬化发生率[17.46%(11/63)比33.33%(21/63)]均低于低水平组,高密度脂蛋白高于低水平组(P<0.05);Pearson相关分析法分析显示血清Beclin1水平与糖尿病颈动脉粥样硬化和CIMT水平呈负相关(r=-0.42,P<0.001;r=-0.54,P<0.001),并与三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白也呈负相关(r=-0.42,P<0.001;r=-0.34,P<0.001;r=-0.52,P<0.001),与空腹血糖、糖化血红蛋白水平呈弱负相关(r=-0.31,P<0.001;r=-0.25,P=0.005);与高密度脂蛋白呈正相关(r=0.38,P<0.001);logistic回归分析显示血清Beclin1水平升高(OR=0.32)是CIMT>5 mm的独立保护因素,最佳截断值为2.35μg/L,曲线下面积为0.88,灵敏度和特异度分别为98.00%、70.00%。结论血清Beclin1水平与糖尿病病人颈动脉粥样硬化和CIMT水平呈负相关,CIMT>5 mm的最佳血清Beclin1截断值为2.35μg/L。

基于PI3K/Akt通路探讨电针血清对肌卫星细胞自噬的影响

目的:观察电针血清调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路对肌卫星细胞自噬的影响。方法:原代培养多裂肌卫星细胞,选择传至第3代的肌卫星细胞,按本课题组前期的实验方法获取电针血清,先以空白血清(无血清,仅含培养基)干预细胞12h诱导肌卫星细胞自噬,后将各组细胞随机分为空白血清组、10%电针血清组、10%电针血清+LY294002组、3-MA组,各组分别干预12、24h后,采用CCK-8检测各组细胞的增殖能力,Western blot检测各组细胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Beclin1、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Pax7蛋白的表达变化。结果:CCK-8结果显示,培养12h时,10%电针血清组细胞增殖能力优于其余3组(P<0.05),培养24h时,10%电针血清组细胞增殖能力优于其余3组及12h时电针血清组(P<0.01,P<0.05),10%电针血清+LY294002组和3-MA组优于空白血清组(P<0.01)。Western blot结果显示:12h后,与空白血清组、10%电针血清+LY294002组比较,10%电针血清组和3-MA组p-Akt、Pax7蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05),Beclin1和L C3-Ⅱ蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。24h后,与空白血清组、10%电针血清+LY294002组比较,10%电针血清组和3-MA组p-Akt蛋白表达显著升高(P<0.01),Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达显著降低(P<0.01),10%电针血清组Pax7蛋白表达显著升高(P<0.01);3-MA组Pax7蛋白表达显著高于空白血清组(P<0.01)。与12h时本组比较,空白血清组Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达均显著升高(P<0.01),Pax7蛋白表达显著降低(P<0.01),10%电针血清组Pax7蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:电针血清可改善肌卫星细胞的过度自噬,保护肌卫星细胞的增殖,该作用可能与激活PI3K/Akt通路有关。