动物细胞无血清培养基的研究与设计方法

随着哺乳动物细胞培养规模的扩大和生物药物需求的增长,基于细胞及产品特性的无血清培养基的研制已成为细胞工程领域的重要课题。运用统计学实验方法,可科学有效地考察细胞培养基中多因素、多水平间的交互作用。应用新型蛋白质组分析技术及生物芯片技术定位胞浆信号通路相关蛋白、膜表面的生长因子受体、激素受体、细胞因子受体、粘附分子等,用于确定细胞培养基中调控分子的添加组合。系统概述了目前无血清培养基几种新型及常用的研究和设计方法,并对其应用特点作了分析,希望为动物细胞无血清培养基的研制提供可借鉴的思路。

改良无血清法培养新生SD乳鼠原代海马神经元细胞

目的探讨改良无血清法培养新生SD乳鼠原代海马神经元细胞的效果及注意事项。方法2018年2-12月共解剖分离72只出生24 h内SD乳鼠的海马,采取Neurobasal+B27改良无血清法培养原代海马神经元细胞。铺板前使用Invitroge自动细胞计数仪计数存活及死亡细胞。细胞贴壁生长0 d、3 d、6 d、9 d、12 d时使用激光共聚焦显微镜观察神经细胞形态变化。结果平均每只乳鼠的海马可分离出(8.40±2.86)×10^(5)个神经细胞,其中存活细胞数为(5.48±1.73)×10^(5),死亡细胞数为(3.08±1.30)×10^(5),细胞总存活率为69%。细胞贴壁后第3天可观察到轴突长出,第6天树突长出,第9天和第12天可观察到周围神经细胞轴突、树突连成神经网络。贴壁后第3天胞体逐渐变大变饱满,最后呈扁圆形。细胞可存活4周左右。结论改良无血清法可用于培养原代海马神经元细胞,快速精准解剖分离及轻柔有效吹打海马组织是培养出高存活率和高活性原代海马神经元细胞的关键。

神经干细胞提取与培养方法的比较研究

目的探讨神经干细胞(neural stem cells,NSCs)提取、培养的最佳方法,为NSCs的基础研究提供技术参考。方法对NSCs的不同提取、培养方法进行比较:提取胎鼠与乳鼠的大脑皮质、采用不同类型培养基、不同接种密度、不同培养方法、不同换液方法、不同传代方法,观察NSCs的成球率和NSCs未分化状态的稳定性。用多功能微孔板读数仪检测NSCs活性。结果 (1)胎龄14 d胎鼠较新生24 h内乳鼠的大脑皮质提取NSCs的比例高,杂细胞少,形成的神经球数量多。(2)采用无血清培养基,NSCs可以稳定在未分化状态;而采用含血清培养基,NSCs多数分化为神经元和胶质细胞。(3)以1.0×109·L^(-1)密度接种的NSCs,培养形成的神经球数量多,且状态良好。(4)悬浮培养法较贴壁培养法,可以形成稳定的神经球,有利于保持NSCs处于未分化的状态。(5)半量换液法和只加液不弃液法培养形成的神经球的状态优于全量换液法。(6)原代和1代的神经球用机械吹打法传代后,NSCs的活细胞比例高,再次形成的神经球状态好,且较其他两种方法简便;2代及以后的神经球用Accutase酶传代后,NSCs的活细胞比例高,再次形成的神经球状态好。(7)14 d胎鼠Accutase酶消化组的NSCs活性高于另外3组,差异均具有显著性(P<0.05)。结论提取胎龄14 d胎鼠的大脑皮质,采用无血清培养基,以1.0×10~9·L^(-1)1的密度接种于25 cm^2培养瓶,采取悬浮培养法,每2~3 d加液1~1.5m L,每6~7 d传代1次,所得到的NSCs增殖分裂旺盛,成球率高,神经球状态良好,可以保持稳定的未分化状态。

树突状细胞体外培养体系的优化

目的:探讨无血清专用培养基从人外周血单个核细胞(DC)分离培养树突状细胞的优化方法。方法:取正常成人新鲜血液,经密度梯度离心法,利用连续贴壁的方法获得单个核细胞,采用无血清培养基经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导产生成熟DC,倒置显微镜观察树突状细胞结构,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平。结果:连续贴壁法无血清专用培养基体外分离培养人外周血DC,所获得DC数量和纯度均都多于以往一次贴壁分离含10%胎牛血清RPMI培养基培养的DC。培养1周的DC高表达CD83、HLA-DR、CD80、CD86、CD83+HLA-DR+及CD80+CD86+。结论:采用无血清专用培养基连续贴壁法可分离培养数量较大、纯度较高的人外周血来源的DC。

不同培养条件对CD133^(+)原代口腔鳞癌细胞干性维持的影响

目的:通过将CD133^(+)/-细胞从原代口腔鳞癌细胞中分离纯化,探索不同培养条件对CD133^(+)原代口腔鳞癌细胞的干性维持及生物学特性的影响。方法:应用CCK-8法检测CD133^(+)/-细胞亚群体外增殖能力以及对顺铂抵抗耐受能力,利用Transwell法检测顺铂对CD133^(+)/-细胞亚群侵袭能力的影响。以无血清培养法(含或不含白血病抑制因子LIF)和含血清培养法分别培养CD133^(+)细胞亚群,流式细胞仪分析CD133^(+)细胞的比例变化。在动物实验模型中验证CD133^(+)和CD133-细胞致瘤能力的差异,最后将移植瘤取出,行H-E染色和免疫组织化学染色。采用SPSS 25.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与CD133-细胞亚群相比,CD133^(+)细胞具备较强的体外增殖能力(P<0.05)和顺铂化疗耐受能力(P<0.001)。顺铂对CD133-细胞亚群侵袭能力的影响更强(P<0.01)。无血清培养法更能维持CD133的比例(P<0.05),无血清培养基是否添加LIF对CD133的比例维持无显著差异(P>0.05)。在裸鼠体内成瘤实验中,CD133^(+)细胞亚群以较少的数量级表现出较强的致瘤能力(P<0.05)。结论:无血清培养法可较好地维持原代口腔鳞癌细胞干细胞特性,添加LIF对原代口腔鳞癌细胞的干性维持无显著影响。