茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选

用CodeHop方法设计简并引物并克隆得到了GAPDH、β-actin、α-tubulin、UBQ5、RPL4、eIF4A和eEF1α7个看家基因的部分序列,将这7个基因和GenBank中已公布的18SrRNA、NADHD2个基因共9个基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析其在茎点枯病菌诱导下芝麻中的表达稳定性。经BestKeeper、NormFinder和GeNorm软件分析可知,UBQ5、eIF4A、α-tubulin3个基因表达均较稳定,eEF1α变化最大。当使用多基因作为内参基因时,选择这3个最稳定的候选内参基因即可准确矫正定量结果。

菜豆壳球孢侵染芝麻过程中内参基因的筛选

为选择适合菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)侵染芝麻过程中实时荧光定量PCR分析的内参基因,11个基因作为候选内参基因。经过PCR扩增效率筛选,β-肌动蛋白(ACTB)、泛素连接酶(UBC)、α-微管蛋白(TUBA)、γ-微管蛋白(TUBC)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、核糖体蛋白S5(RPS5-a,RPS5-b)和内部转录间隔区(ITS)8个基因符合要求,可用于稳定度筛选。利用实时荧光定量PCR技术,检测了这8个候选基因在菜豆壳球孢侵染芝麻8h、16h、24h和32h的表达情况。经Ge Norm软件分析,ACTB、GAPDH和RPS5-b等3个基因表达较稳定。经过最适内参基因数目分析,在菜豆壳球孢侵染芝麻过程中基因定量表达分析时,选择ACTB、GAPDH和RPS5-b的多基因组合作为内参,能够更准确地校正定量结果。

芝麻NBS类抗茎点枯病相关基因的克隆与分析

根据前期获得的芝麻抗茎点枯病NBS-RGAs序列与河南省芝麻研究中心提供的EST序列比对结果,设计4对特异引物,从10个对茎点枯病表现不同抗性的芝麻品种中扩增得到16条RGAs(抗病基因同源序列),GenBank登录号分别为KC477692～KC477707,它们编码的氨基酸序列均具有NBS(核苷酸结合位点)类型抗病基因的特征结构域。Blastx分析结果表明,16个RGAs基因编码的部分氨基酸序列与已知NBS类抗病蛋白同源性为35%～52%。聚类分析发现这些RGAs基因聚为4类,且均为non TIR-NBS类型,为进一步筛选芝麻抗茎点枯病基因奠定了基础。