RT-PCR及RFLP分析技术对鸡传染性支气管炎病毒的诊断和S1基因分型的研究

本研究使用分别扩增整个S1糖蛋白基因 (引物A)和S1糖蛋白基因N_端高变区Ⅰ (引物B)的 2对引物对 3个IBV标准株M41、Connecticut、Arkansas及 5个地方分离株 (C60 ,D41A ,D41B ,A112 1,A1171)进行RT_PCR扩增。用引物A时 ,有 5个IBV毒株扩增到目的片段 (172 0bp) ;用引物B时 ,所有 8个IBV毒株均得到与预计大小相符的目的产物 (2 2 8bp)。对 172 0bp的PCR产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切 ,结果得出 3个不同的RFLP图谱 ,其中M41、Connecticut、D41B具有相同的HaeⅢ酶切图谱。Arkansas和D41A则分别具有互不相同的图谱 ;对 2 2 8bp的PCR产物进行DdeⅠ、RsaⅠ限制性内切酶消化 ,根据它们的RFLP图谱 ,8个IBV毒株可分为 5个基因型。综合 2对引物的PCR产物的RFLP分析结果 ,8个IBV毒株可分为 7个基因型 ,分型的结果与传统的血清学方法吻合。本研究建立的方法和技术具有快速、简单、特异、灵敏等优点 ,为现场流行毒株的定型(基因型 /血清型 )及其S1基因变异的跟踪研究以及更有效防制传染性支气管炎奠定了基础。

湖北省不同地区汉坦病毒的基因型研究

目的 对分离自湖北省不同地区的 30株汉坦病毒 (HV)RNAM片段进行分析 ,以了解湖北省不同地区HV的基因特征及基因组功能。方法 参考HV的基因文库软件设计M片段G1 区型特异性引物 ,用适合于湖北省HV分型的逆转录 -半巢式聚合酶链反应 (RT -heminestedPCR) ,并结合限制性内切酶酶切图谱分析 ,对湖北省不同地区分离的 30株HV进行分型、酶切。结果 分离于湖北省不同地区的 30株HV的分型结果为汉滩型 2 1株、汉城型 9株。 2 1株汉滩型靶基因被HinfⅠ、HaeⅢ消化的图形与标准株 76/ 1 1 8株的图形一致 ,未见与H - 1 1 4株相似的图形 ,其中武汉和洪湖各有l株靶基因HaeⅢ消化只见 1个片段 ;应城、江夏、黄陂和麻城各有 1株靶基因HinfⅠ消化有 3个片段。另外 2 1株汉滩型靶基因除前述的应城毒株外均被HincⅡ消化。 9株汉城型靶基因不能被HaeⅢ消化 ;HinfⅠ消化只见 2个片段 ,而EcoRⅠ消化却见 2个片段 ,与R2 2 株消化的图形不一致。结论 湖北省HFRS流行为混合疫区 ;汉城型M片段基因稳定 ,汉滩型M片段基因不稳定 ,且在湖北地区具有一定的地理聚族性。

性反转综合征患者SRY基因检测及病因分析

目的研究性反转综合征的发生与性别决定基因SRY(sex-determining region on the Y chromosome)之间的关系。方法应用聚合酶链反应(polymerase-chain reaction,PCR)对2例46,XX男性性反转及1例46,XY女性性反转患者进行SRY扩增,并将扩增产物在ABI-377测序仪上测序。结果2例46,XX男性性反转患者SRY检测1例阳性,1例阴性。46,XY女性性反转患者SRY阳性,2个SRY阳性病例DNA序列分析均未检测到突变。结论SRY是性别决定和分化的重要基因,SRY阴性XX男性性反转及SRY阳性但无突变的XY女性性反转的发生,可能与其它性别分化相关基因的异常有关。

SRY基因诊断在临床中的应用

本文应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术，对１０例染色体核型为４６，ＸＹ和１例为４６，ＸＸ／４６，ＸＹ的性反转、睾丸女性化、两性畸形及男性生殖器发育不良的患者进行了性别决定区（ＳＲＹ）基因检测。结果９例４６，ＸＹ和１例４６，ＸＸ／４６，ＸＹ患者的ＳＲＹ基因存在，１例４６，ＸＹ女性患者的ＳＲＹ基因缺失。该结果表明，采用分子生物学技术对性反转、性发育异常的病因可进行分析。

SRY基因检测在性分化异常诊断中的应用

目的 研究SRY基因在性分化和发育中的作用。方法 细胞遗传学核型分析技术以及PCR技术检测外周血SRY基因。结果 在 12例性分化异常患者中 ,有 7例核型为 4 6 ,XY ,SRY(+) ,其中 1例是睾丸女性化综合征。说明性腺病理有睾丸与外周血SRY相符。另有 5例核型为 4 6 ,XX。其中 1例外周血SRY(+) ,显示性反转综合征 ;1例为Turner嵌合型综合征 ,核型为 4 6 ,XX/ 4 5 ,X ,SRY(- ) ,但睾酮升高 (12 .7nmol/L) ,正常成年女性睾酮参考值 (0 .7～ 2 .8nmol/L)。 3例外周血SRY为 (- )。结论 SRY基因检测比外周血核型更能预示睾丸组织的存在 ,性腺的病理取决于性腺部位的染色体核型和SRY基因。除SRY基因外 ,可能存在多个参与性别决定和分化的基因。性分化异常表现出高度遗传异质性。

人类维甲酸受体α的克隆表达

目的:构建人类维甲酸受体α基因的高效表达系统。方法:提取人肝组织总RNA,RT-PCR扩增Retinoid X receptorα(RXRα)的cDNA。将其克隆入原核表达载体pETDuet-1,构建重组表达载体pETDuet-1/RXRα。将已构建好的表达载体pETDuet-1/RXRα重组质粒转化大肠杆菌BL21,异丙基硫代-8-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western Blot鉴定表达产物。结果:重组载体pETDuet-1/RXRα经限制性核酸内切酶BglⅡ和AatⅡ双酶切鉴定,得到符合预期大小的核酸片段。SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带,Western Blot证实该条带即为RXRα。并对重组质粒pETDuet-1/RXRα在BL21菌株的表达效率进行评价,目的蛋白占菌体总蛋白的百分比为65.8%。结论:成功建立了pETDuet-1/RXRα的高效表达系统。

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３／ Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达． 方法：将 Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 真核表达载体上，经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞，了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性． 结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３／ Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ表达质粒克隆成功，转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的 Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ蛋白．结论：以脂质体介导ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３／ Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ质粒转染真核细胞有可能用于帕金森氏症的基因治疗．

性分化异常的遗传学诊断

目的 :研究SRY基因在性分化和发育中的作用。方法 :细胞遗传学核型分析技术结合PCR技术检测外周血SRY基因。结果 :在 12例性分化异常患者中 ,有 7例核型为 4 6 ,XY ,SRY(+) ,其中 1例为睾丸女性化综合征。说明性腺病理有睾丸与外周血SRY相符。另有 5例核型为 4 6 ,XX。其中 1例外周血SRY(+) ,显示性反转综合征 ;1例为Turner嵌合型综合征 ,核型为 4 6 ,XX 4 5 ,X ,SRY(- ) ,但睾酮升高 (12 7nmoL L)。正常成年女性睾酮参考值 (0 7～ 2 8)nmoL L。 3例外周血SRY为 (- )。结论 :SRY基因检测比外周血核型更能预示睾丸组织的存在 ,性腺的病理取决于性腺部位的染色体核型和SRY基因。除SRY基因外 ,可能存在多个参与性别决定和分化的基因。

SRY基因诊断在临床中的应用

应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术，对１０例染色体核型为４６，ＸＹ和１例为４６，ＸＸ／４６，ＸＹ的性反转、睾丸女性化、两性畸形及男性生殖器发育不良的患者进行了性别决定区（ＳＲＹ）基因检测。结果表明９例４６，ＸＹ和１例４６，ＸＸ／４６，ＸＹ患者的ＳＲＹ基因存在，１例４６，ＸＹ女性患者的ＳＲＹ基因缺失。该结果表明能够用分子生物学技术对性反转。

甲基化特异性PCR联合结合重亚硫酸盐限制性内切酶法在胃癌抑癌基因甲基化检测中的应用

目的探讨甲基化特异性PCR(MSP)方法检测胃癌组织中抑癌基因甲基化的准确性,联合应用MSP方法与结合重亚硫酸盐限制性内切酶法(COBRA)检测抑癌基因甲基化状态的意义。方法采用MSP检测胃癌组织抑癌基因Runx3启动子区甲基化的状态,随后再采用COBRA检测胃癌组织标本的甲基化状态。分析两种方法检测结果的关系。结果经MSP方法检测54例肿瘤组织中共有30例标本发生Runx3基因启动子区异常甲基化,甲基化阳性率为55.6%。经COBRA方法检测54例肿瘤组织中有27例出现酶切条带即存在甲基化,甲基化阳性率为50.0%。经COBRA方法检测,在MSP方法检测的30例阳性标本中有3例未出现酶切条带即为假阳性。在MSP方法检测Runx3基因甲基化阴性的24例标本中,经COBRA方法检测,Runx3基因甲基化阴性的标本亦为24例。两种检测方法检测结果的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论甲基化特异性PCR方法在检测胃癌抑癌基因甲基化状态的研究中具有较高的灵敏度,COBRA方法可以检测出MSP方法中的假阳性标本,联合应用两种方法检测胃癌组织中抑癌基因的甲基化状态会使实验结果更可靠、准确。

中国人新SRY基因突变类型－Codon76CGC→CCC的发现

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）体外快速扩增６例４６，ＸＹ女性性反转综合征患者的ＳＲＹ基因片段，并用一种简单准确的ＰＣＲ产物直接测序法进行序列分析，发现一种Ｃｏｄｏｎ７６ＣＧＣ→ＣＣＣ的新突变类型，对该直接测序法的关键和应用进行了讨论。

多肿瘤抑制基因第二外显子表达载体的构建

目的建立人多肿瘤抑制基因（ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｕｍｏｒｓｕｐ－ｐｒｅｓｓｏｒ１，ＭＴＳ１）第二外显子ｃＤＮＡ表达克隆。方法用反转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）取得ＭＴＳ１第二外显子ｃＤＮＡ，并将其直接联接入质粒ｐＧＥＭⅳ－Ｔ中，构建为重组质粒ｐＧＥＭⅳ－ｐ１６。结果重组质粒的酶谱分析表明其酶切位点与原设计相符，插入ｃＤＮＡ－ＰＣＲ片段大小为３０７ｂｐ，与引物区间大小一致。

46,XX男性和46,XX/45,X病例分析

目的探讨SRY基因在性分化和发育中的作用。方法细胞遗传学核型分析以及PCR技术检测外周血SYR基因。结果病例1的核型为46,XX,SRY(+)。诊断为46,XX男性性反转综合征。病例2的核型为46,XX/45,X,SRY(-)。诊断为Turner嵌合型。结论SRY基因检测比Y染色体更能预示睾丸组织的存在,是诊断性别发育异常患者的重要手段。性腺的病理取决于性腺组织的染色体核型和SRY基因。除SRY基因外,还存在多个参与性别决定和分化的基因,性分化异常表现现高度遗传异常性。

HLA-DR_α基因片段TA克隆载体的构建

目的 应用TA克隆技术构建含HLA-DRα基因的载体,作为实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测 HLA-DRα基因的标准模板。方法 利用RT-FCR法,从提取的外周血单核细胞总RNA中特异地扩增含635bp的HLA- DRαcDNA片段,并将其克隆到TA载体。结果 用限制性内切酶法和测序方法证实扩增片段为目的片段。结论 成功地构建了 HLA-DRα基因片段TA克隆载体。为实时荧光定量RT-PCR法检测HLA-DRαmRNA表达提供标准模板。

46XY女性性反转综合征一例sry基因的错义突变分析

目的探讨46XY女性性反转综合征患者发病的分子机制。方法应用荧光原位杂交技术(FISH)、聚合酶链反应(PCR)扩增、限制性内切酶分析、单链构象多态性分析及基因测序技术对1例46XY女性性反转综合征进行sry基因的错义突变分析。结果本例FISH证实为X、Y染色体结构,无嵌合体存在;PCR扩增出现609 bp特异性片段;限制性内切酶分析及单链构象多态性分析发现单链电泳带发生变异;且基因克隆测序分析证实HMG盒内第244位核苷酸位置存在点突变(A→T),造成第82位密码子由原来编码天冬酰胺Asn(AAT)变为编码酪氨酸Tyr(TAT),发生错义突变,以致出现女性表型。结论 sry基因在性别决定中起主导作用,对46XY女性患者应在sry基因检测的基础上寻找其他相关病因,以进一步了解其发生性反转的分子遗传学机制,为判断真实性别提供依据。

自发性癫痫大鼠脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调

[目的]对照研究自发性癫痫大鼠(SER)和正常 Wistar 大鼠(WTC)脑内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型钠通道α亚基mRNAs与蛋白表达情况。[方法]提取枕叶皮质、齿状回及海马 CA1和 CA3区组织总 RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及建立限制性内切酶图谱检测Ⅰ、ⅡA、ⅡN、ⅢA和ⅢN的表达.应用免疫荧光定位与表达α_3亚基川 N 蛋白。[结果]SER枕叶皮质、齿状回及海马CAl和CA3区总钠通道的表达略高于 WTC,但均无显著差异(P>0.05),SERⅢ型钠通道在海马的表达高于 WTC(P<0.01),酶切图谱显示ⅢN型钠通道表达水平有明显上调。[结论]SER 脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道 N 亚型表达上调。

8例46，XX男性和16例46，XY女性的SRY序列研究

为探讨Ｙ染色体性别决定区基因（ＳＲＹ）在性分化中的作用。在染色体核型分析的基础上，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和直接测序技术，对８名４６，ＸＸ男性和１６名４６，ＸＹ女性患者进一步作了ＳＲＹ序列的分析研究。结果发现：２例４６，ＸＸ男性的ＤＮＡＰＣＲ扩增出现特异的ＳＲＹ序列扩增片段；１例４６，ＸＹ女性的ＳＲＹ核心序列ｃｏｄｏｎ１１３出现Ａ→Ｔ的新生突变；１例４６，ＸＹ女性的ＳＲＹ编码序列上游ＡＡＣＡＡＧ区（转录因子结合位点）处碱基Ｇ→Ａ突变。上述研究结果提示：ＳＲＹ基因是性发育的重要遗传学基础，并为进一步揭示ＳＲＹ基因的结构与功能的关系和在临床上对性反转综合征患者的诊断、治疗提供有价值的科学资料。

七例46，XY女性的SRY基因分析

应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、ＰＣＲ扩增、ＤＮＡ序列分析技术对７例４６，ＸＹ女性性反转综合征患者的ＳＲＹ基因进行了研究。结果表明：一例缺失ＳＲＹ基因；一例存在ｃｏｄｏｎ７６ＣＧＣ→ＣＣＣ点突变；另一例存在ｃｏｄｏｎ９４ＣＴＧ→ＣＣＧ的点突变；其余４例与正常成年男性的ＳＲＹ基因相同。为研究４６，ＸＹ女性性反转综合征的发病机理提供了有价值的资料。

性反转综合征患者的细胞及分子遗传学分析

目的:探讨检测SRY基因和Y染色体AZF因子在性反转综合征患者临床分子诊断中的应用价值及性反转综合征的机制。方法:运用细胞遗传学核型分析技术和聚合酶链反应(PCR)对7例46,XY女性性反转患者及1例46,XX男性性反转患者进行染色体核型分析、SRY基因扩增和Y染色体AZF因子扩增,SRY阳性的扩增产物进行序列测序。结果:7例46,XY女性性反转中4例SRY和Y染色体AZF因子检测阳性,3例SRY和Y染色体AZF因子检测阴性;1例46,XX男性性反转患者SRY和Y染色体AZF因子检测阴性。4例SRY阳性病例DNA序列分析均未检测到突变。结论:SRY是决定性别和分化的重要基因,Y染色体AZF因子有辅助检测的作用,对性反转综合征患者进行检测有利于明确病因,为其诊断和治疗提供科学依据。性反转综合征可能与其它性别分化相关基因的异常有关,需深入进行细胞、分子遗传学研究。

MeCP2基因热点突变分析在Rett综合征诊断中的应用

目的 探讨MeCP2基因常见突变是否对Rett综合征临床诊断有帮助。方法 对 2 3例Rett综合征患儿 ,部分患儿家长和 4名正常女性分别提取外周血基因组DNA。采用PCR方法扩增MeCP2基因第 3外显子nt2 2 6 4 3～nt2 30 2 2片段 ,限制性内切酶HphⅠ和NlaⅢ酶切分析T15 8M和R16 8X突变 ,6 %聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检验酶切结果 ,突变点经DNA直接测序证实。结果 2 3例Rett综合征患儿中 4例有T15 8M突变 ,2 1例患儿中 2例有R16 8X突变。在患儿双亲及正常女性对照均未发现以上 2种突变。结论 T15 8M和R16 8X 2个突变在Rett综合征均较多发。PCR产物的限制酶分析 ,方法简便、快捷 。