Investigation of SRY Gene in Sex Reversed Syndrome Patients

SRY (sex-determining region Y chromosome) is considered as a strong candidste for the TDF (testis determining factor) and has been cloned following another candidate ZFY (zinc finger protein gene). In this study,eight cases of sex revelsal, including four 46, XX males and four 46, XY females aere examined for the presence of SRY sequence and a Y-repeated DNA locus. Our data indicated that the genownic DNA of the four classical 46,XX males had the SRY sequences. On the other hand, both SRY sequences and Ye repeated DNA sequences were present in all four 46, XY females.These resultssuavest that SAY sequences were responsible for the sexraversal of 46, XX males Whereas there may be other genetic mechanisms forthe sex reversal of 46, XY females Without the lack of SRY sequences.

PCR扩增Sry基因进行鲸类动物性别的鉴定

哺乳动物Y染色体短臂上的Sry基因决定雄性发育方向。本研究参照哺乳动物Sry基因保守区序列设计引物 ,以非性别特异性的线粒体DNA细胞色素b基因作为阳性对照 ,用PCR扩增江豚、长喙真海豚等鲸类动物的Sry基因片断并对其进行凝胶电泳分析来鉴定鲸类动物的性别。通过此方法对 87个已知性别鲸类动物标本的检验 ,结果完全正确 ,并进一步应用此方法成功地完成了另外 33个未知性别鲸类标本的性别鉴定。由此建立了一套简单、快速。

染色体显微切割与DOP-PCR结合对赤麂Sry基因克隆、测序及初步定位

应用显微切割技术获得赤麂１号、Ｙ１、Ｙ２染色体，通过ＤＯＰ－ＰＣＲ增加模板ＤＮＡ拷贝数，然后用人的性别决定基因（Ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｙ， ＳＲＹ）中ＨＭＧ框内设计１对引物，对ＤＯＰ－ＰＣＲ产物进行扩增。在雄性赤麂Ｙ２染色体ＤＯＰ－ＰＣＲ产物中扩增出与人ＳＲＹ基因同源的Ｓｒｙ基因片段，克隆、测序，首次在分子水平上证明赤麂Ｙ２染色体是真正的Ｙ染色体，同时对赤麂Ｓｒｙ基因进行了初步定位。

应用Sry-PCR扩增鉴定狍(Capreolus capreolus)的性别

根据人的SRY基因核心序列设计合成1对引物C1、C2,应用PCR技术对野生狍(Capreoluscapreolus)Sry基因(哺乳动物Y染色体DNA雄性特异区)进行扩增,结果在野生狍雄性样本扩增出1条带(221bp),而在雌性样本未见扩增带,显示了Sry基因的性别特异性。应用这1对引物对42个未知性别狍肌肉组织样本进行了性别鉴定,结果雄性22个,雌性20个。对Sry-PCR产物克隆测序,得到185bp的Sry基因部分核苷酸序列。本试验为狍种群性别比率及其种群动态变化机制研究提供了资料。

嵌套式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别体系的建立

应用源自牛X和Y染色体同源区的1对外引物P1、P2及其各自特异区的2对内引物P3、P4和P5、P6,进行嵌套式PCR反应,对中国荷斯坦公、母牛静脉血样DNA及牛胚胎样DNA进行特异性条带的嵌套式PCR扩增,并对外、内嵌套式引物的PCR反应体系进行了优化,以准确鉴定牛早期胚胎性别。结果表明,在优化了的PCR反应体系下,中国荷斯坦公牛DNA样品得到178bp和262bp的两个条带,而母牛仅得到262bp的1个条带;静脉血样DNA性别鉴定结果与实际性别相符率为100%,表明本试验建立的体系完全可以用于牛早期的胚胎性别鉴定。

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物,根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明:使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段,母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段;而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段,母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段,其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果,而常规PCR则需要20～30个细胞,所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别,同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。

水牛胚胎性别鉴定的PCR方法

根据荷斯坦牛SRY基因设计1对引物扩增得到水牛SRY基因的全长序列2005 bp,对该片段测序后,设计2对特异于水牛SRY基因核心区的引物用于早期胚胎性别鉴定,同时根据水牛G3PDH基因设计2对引物作为内对照共同扩增,建立了多重巢式PCR体系并进行优化,使用优化后的PCR体系对取样后的27枚IVF胚胎和24枚Y精子受精胚胎进行检测,并使用斑点杂交检测扩增准确率。结果表明,27枚IVF胚胎均能有效扩增,雄性、雌性比例分别为51.9%(14/27)、48.1%(13/27),斑点杂交表明扩增准确率为100%;24枚Y精子受精胚胎的雄性比例为83.3%(20/24)。该巢式多重PCR方法具有很高灵敏度和稳定性,能够在实际生产中应用。

性反转综合征的SRY基因分析

目的:探讨性反转综合征(sex reversal syndrome,SRS)的发病原因。方法:应用聚合酶链式反应(PCR)及PCR产物直接测序方法对22例性发育异常患者的人类性别决定区域(sex-determining region of Y chromosome,SRY)基因进行特异性扩增和序列检测分析。结果:在22例患者中有7例患者SRY基因检测结果与染色体性别不一致,其中3例为46,XX女性性反转患者的SRY基因为阳性(其中1例46,XX,Gp+),3例为46,XY男性性反转患者的SRY缺失,1例为45,X女性患者的SRY基因阳性;其他15例患者SRY基因与染色体性别一致,但都伴有不同程度的性发育异常,即存在Y染色体患者,SRY为阳性;无Y染色体的患者,SRY为阴性。通过对12例SRY阳性患者进行测序分析,均未发现碱基突变。结论:SRY基因的缺失或易位是导致SRS的最主要原因,同时也表明人类的性别决定和分化还有其他相关基因参与。

性反转综合征患者SRY基因检测及病因分析

目的研究性反转综合征的发生与性别决定基因SRY(sex-determining region on the Y chromosome)之间的关系。方法应用聚合酶链反应(polymerase-chain reaction,PCR)对2例46,XX男性性反转及1例46,XY女性性反转患者进行SRY扩增,并将扩增产物在ABI-377测序仪上测序。结果2例46,XX男性性反转患者SRY检测1例阳性,1例阴性。46,XY女性性反转患者SRY阳性,2个SRY阳性病例DNA序列分析均未检测到突变。结论SRY是性别决定和分化的重要基因,SRY阴性XX男性性反转及SRY阳性但无突变的XY女性性反转的发生,可能与其它性别分化相关基因的异常有关。

双温多重PCR鉴定猪早期胚胎性别的研究

通过PCR扩增哺乳动物雄性决定基因SRY来鉴定胚胎的性别在畜牧业生产上已经得到广泛应用,优化技术路线,缩短鉴定时间对后期实验的成功有非常重要的意义。根据猪的SRY基因和GAPDH(内标)基因序列,分别设计并合成两对引物,通过双温PCR反应实现对猪早期胚胎性别的快速鉴定,结果表明:母猪只能扩增出404bp的GAPDH基因片段,而公猪能同时扩增出309bp的SRY基因片段和404bp的GAPDH基因片段。阳性率为100%,鉴定时间较常规时间缩短2h时。表明该检测方法快速、准确。该方法为在转基因克隆动物研究中快速鉴定胎儿成纤维细胞系的性别提供了可靠的技术保证。

应用巢式及复合PCR对小鼠早期胚胎进行性别鉴定

根据小鼠SRY基因,设计并合成内外两对巢式PCR引物;同时,根据ZFY—ZFX基因的同源性,设计 合成其共同的巢式PCR引物,对昆白小鼠组织DNA样品进行了性别鉴定,雄性样品可扩增262bp的SRY基 因和137bp的ZFY-ZFX基因片断,而雌性样品只能扩增137bp的ZFY—ZFX基因片断,其鉴定结果与已知性别 一致。将2-细胞、4-细胞、8-细胞和16细胞胚胎视为微量细胞样品进行PCR扩增,通过常规PCR与巢式PCR、 复合PCR的比较,确立了巢式及复合PCR的扩增体系。结合核型分析和PCR法共鉴定21枚胚胎,其中雄性12 枚,雌性8枚,鉴定准确率为95．2％。

46,XY女性性反转患者SRY基因启动子区一个新的点突变及其功能分析

通过ＤＮＡ序列测定在一名４６，ＸＹ女性性反转患者ＳＲＹ基因启动子区发现了一个新的突变：ｎｔ．－８１Ｇ→Ａ．该突变不见于正常男性，因此不是ＤＮＡ多态性．为了检测这一点突变对ＳＲＹ基因表达功能的影响，构建了分别由正常或突变的人ＳＲＹ基因启动子区片段调控氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）报告基因表达的两个质粒，寡核苷酸探针杂交证实该启动子片段正常或携带有Ｇ→Ａ突变．这两个质粒分别与ｐＳＶ－β－半乳糖苷酶内对照质粒共转染ＨｅＬａ细胞后，瞬间表达分析显示这一突变对ＣＡＴ酶活性水平无显著影响（０．５０＞Ｐ＞０．２０）．上述正常和突变的ＳＲＹ基因启动子片段与Ｋ５６２细胞核抽提物的凝胶阻滞实验也表明，突变对Ｋ５６２细胞核蛋白与ＳＲＹ基因启动子区的结合影响不大．

SRY基因诊断在临床中的应用

本文应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术，对１０例染色体核型为４６，ＸＹ和１例为４６，ＸＸ／４６，ＸＹ的性反转、睾丸女性化、两性畸形及男性生殖器发育不良的患者进行了性别决定区（ＳＲＹ）基因检测。结果９例４６，ＸＹ和１例４６，ＸＸ／４６，ＸＹ患者的ＳＲＹ基因存在，１例４６，ＸＹ女性患者的ＳＲＹ基因缺失。该结果表明，采用分子生物学技术对性反转、性发育异常的病因可进行分析。

SRY基因检测在性分化异常诊断中的应用

目的 研究SRY基因在性分化和发育中的作用。方法 细胞遗传学核型分析技术以及PCR技术检测外周血SRY基因。结果 在 12例性分化异常患者中 ,有 7例核型为 4 6 ,XY ,SRY(+) ,其中 1例是睾丸女性化综合征。说明性腺病理有睾丸与外周血SRY相符。另有 5例核型为 4 6 ,XX。其中 1例外周血SRY(+) ,显示性反转综合征 ;1例为Turner嵌合型综合征 ,核型为 4 6 ,XX/ 4 5 ,X ,SRY(- ) ,但睾酮升高 (12 .7nmol/L) ,正常成年女性睾酮参考值 (0 .7～ 2 .8nmol/L)。 3例外周血SRY为 (- )。结论 SRY基因检测比外周血核型更能预示睾丸组织的存在 ,性腺的病理取决于性腺部位的染色体核型和SRY基因。除SRY基因外 ,可能存在多个参与性别决定和分化的基因。性分化异常表现出高度遗传异质性。

扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明:第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA无此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;

联合应用STR和SRY基因分型技术分析性分化异常者

目的对Amelogenin分型结果为"X,X"的一名"男孩"进行性别确认。方法采用STR检测和SRY基因检测技术进行分析。结果孩子STR、X-STR的检验结果符合女性性别特征,SRY基因检测结果为阴性。结论应用STR、X-STR检测和SRY基因检测技术可以确证"男孩"Amelogenin基因座结果为"X,X",推断其患有"46,XX"男性性反转综合症。

三种性分化异常综合征患者的SRY基因检测

目的 探讨Klinefelter综合征、4 6 ,XY女性性反转综合征和Turner综合征患者是否存在SRY基因 ,进一步了解SRY基因在性分化中的作用。方法 用SRY特异性引物通过PCR方法检测三种性分化异常患者外周血淋巴细胞SRY基因。结果 7例Klinefelter综合征患者有 1例未测出SRY基因 ,6例SRY基因阳性 ;3例 4 6 ,XY女性综合征患者SRY基因均阳性 ;7例Turner综合征患者SRY基因皆阴性。结论 SRY基因是睾丸分化和发育的关键基因 ,但正常男女性分化还需要其他基因或因素的作用。

不同妊娠状态下母体循环中胎儿游离DNA—SRY基因的定量检测

目的依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论，从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA并加以鉴定，预防X连锁遗传病患儿的出生。方法从孕早期、中期及晚期共80名孕妇外周血浆中分离胎儿DNA，采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative polymerase chain—reaction，FQ—PCR）方法对不同妊娠状态下孕妇外周血中游离的胎儿DNA（fDNA）进行定量分析，初步探讨游离fDNA在不同妊娠状态下的浓度变化，为尽早应用于临床提供科学依据。结果早孕组28例血浆标本中有25例检测到SRY基因，其平均浓度为58．82copies／ml，实测浓度范围为33．7～126．2copies／ml；中孕组20例血浆标本中均检测到SRY基因，其平均浓度为152．08copies／ml，实测浓度范围为37．7～390．2copies／ml；晚孕组32例血浆标本中均检测到SRY基因，其平均浓度为212．34copies／ml，实测浓度范围为87．90～493．56copies／ml。组间两两比较，差异有统计学显著性意义（P〈0．01）。结论用实时荧光定量PCR的方法最早在孕62d的孕妇外周血浆中就可以检测到胎儿sRY基因，随孕周的增加，母血中胎儿DNA的量也在逐渐增加。实时荧光定量PCR技术在进行无创性产前诊断中有重要的价值。

SRY基因诊断在临床中的应用

应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增技术，对１０例染色体核型为４６，ＸＹ和１例为４６，ＸＸ／４６，ＸＹ的性反转、睾丸女性化、两性畸形及男性生殖器发育不良的患者进行了性别决定区（ＳＲＹ）基因检测。结果表明９例４６，ＸＹ和１例４６，ＸＸ／４６，ＸＹ患者的ＳＲＹ基因存在，１例４６，ＸＹ女性患者的ＳＲＹ基因缺失。该结果表明能够用分子生物学技术对性反转。

PCR在动物胚胎性别鉴定中的应用

哺乳动物Y染色体短臂上的SRY基因决定雄性发育方向。阐述了利用PCR（Polymerase Chain Reaction-聚合酶链式反应）技术,通过扩增SRY基因对附植前的胚胎进行性别鉴定的原理方法及其优缺点。