ADAM28 shRNA干扰载体对人牙周膜干细胞增殖、分化和凋亡的影响

目的:探讨金属蛋白酶解离素28(ADAM28)shRNA干扰载体对人牙周膜干细胞(HPDLSCs)增殖、分化和凋亡的影响及作用机制。方法:用ADAM28 shRNA干扰载体转染HPDLSCs 48 h后检测转染效率,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术(FCM)检测细胞周期。酶动力学法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blot检测分化相关基因CAP、Pax9蛋白的表达。FCM测定HPDLSCs凋亡率,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达差异。用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果:重组干扰载体PGPU6/GFP/Neo-ADAM28-shRNA可高效转染HPDLSCs,干扰载体组的细胞增殖活性显著下降,S期、G 2+M期的细胞比例和细胞增殖指数(PI=S+G 2M)明显降低,ALP值明显降低,CAP、Pax9蛋白的表达水平下降,凋亡率显著提高,Bcl-2、Bax蛋白的表达水平上调。结论:ADAM28 shRNA干扰载体抑制HPDLSCs的增殖、分化,诱导HPDLSCs凋亡。其机制可能是干扰载体抑制金属蛋白酶域和类解离素域的催化裂解和类EGF功能域的促细胞增殖作用,阻碍Notch信号传递并参与细胞凋亡负反馈调节机制。

猪源Rab基因shRNA文库与稳定细胞株的构建及其对猪伪狂犬病病毒增殖的影响

【目的】探究Rab家族蛋白在猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)感染宿主细胞中的作用。【方法】以猪肾上皮细胞(PK15)为试验模型,构建Rab基因shRNA文库,并用嘌呤霉素筛选获得稳定的能够抑制猪源Rab基因表达的细胞株。用实时荧光定量PCR检测细胞敲减效率,通过流式细胞术检测敲减Rab基因对PRV增殖的影响;用Western blotting检测PRV-gB蛋白表达量,使用实时荧光定量PCR检测敲减Rab基因后PRV-gB、PRV-TK基因以及相关细胞炎性因子表达量。【结果】试验成功构建包含13种Rab基因敲减细胞系的shRNA文库。流式细胞术检测结果显示敲减Rab基因能显著抑制PRV-GFP增殖(P<0.05);病毒滴度与Western blotting检测结果表明,敲减Rab基因极显著抑制子代病毒的产生以及PRV-gB蛋白的表达(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测结果显示,敲减Rab基因会显著或极显著抑制PRV-gB、PRV-TK基因表达(P<0.05;P<0.01);敲减Rab14和Rab27基因后细胞中IFN-β、ISG15、IL-1β、IL-18基因表达量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01)。【结论】敲减Rab基因能够抑制PRV增殖。研究结果为进一步研究Rab基因在PRV生活周期中发挥的作用奠定基础。

猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体的构建

本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞(ST)中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降(P<0.001),成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功构建重组质粒ACE-shSPAG6-pcDNA3.1,转染ST细胞48h后SPAG6蛋白表达量较阴性对照组显著下调(P<0.001)。本研究成功构建了猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体,并在ST细胞中验证了其具有较好的干扰效果。

绵羊PLC-γ1基因shRNA慢病毒干扰载体的构建及鉴定

为了构建绵羊PLC-γ1基因shRNA慢病毒干扰载体,并在人胚肾细胞(HEK-293T细胞)中筛选及鉴定载体干扰效果,试验采用Invitrogen BLOCK-iTTM RNAi Designer在线软件设计PLC-γ1基因的4条shRNA干扰序列(PLC-γ1-shRNA-1~4)和1条阴性对照序列(PLC-γ1-shRNA-NC),将其分别克隆至慢病毒干扰载体pLentiLox3.7(pLL3.7)中构建PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体,用其转染HEK-293T细胞,48 h后通过倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况,并利用实时荧光定量PCR法和Western-blot检测HEK-293T细胞中PLC-γ1基因和蛋白质的表达情况,筛选出干扰效率最高的PLC-γ1-shRNA干扰序列并计算慢病毒含量。结果表明:试验成功设计出PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体,大小为120 bp。PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体均具有较高的干扰效率,在倒置荧光显微镜下均可观察到绿色荧光蛋白表达,其中PLC-γ1-shRNA-2序列的干扰效率最高,其PLC-γ1基因和蛋白质的相对表达量最低,极显著低于PLC-γ1-shRNA-NC的干扰(P<0.01),慢病毒含量为1.1×10^(7)IU/mL。说明针对PLC-γ1基因筛选出的PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体从基因和蛋白质水平上均能有效地抑制PLC-γ1的表达。

pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒的构建与鉴定

目的构建pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒靶向敲低ZNF703。方法根据人和鼠ZNF703基因序列中的外显子区在RNA干扰平台上(broadinstitute.org)设计shRNA的靶向序列,并根据pLKO.1中Age I和EcoR I酶切位点序列设计并合成ZNF703 shRNA的引物;对引物进行退火;将pLKO.1质粒进行酶切、胶回收;用T4酶进行连接、转化、涂板,对阳性克隆菌落PCR鉴定和测序鉴定;将构建好的质粒利用慢病毒包装并转染HCT-116细胞系,Q-PCR检测ZNF703的敲低效率。结果成功构建pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒,并且利用病毒包装体系构建ZNF703 shRNAHCT-116细胞系,RT-PCR结果显示设计并构建的pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒可用于有效敲低ZNF703。结论成功构建可用于有效敲低人或鼠源细胞系中ZNF703的pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒。

TFEB基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建TFEB基因的shRNA慢病毒载体,并鉴定是否成功。采用该载体包装的慢病毒侵染所获得的细胞系可利用TFEB(转录因子EB)作为靶点,用于TFEB相关性疾病发病机制的研究及为临床疾病研究提供新的药物治疗方向。方法:利用PCR、双酶切、连接、转化等分子生物学技术构建TFEB基因的shRNA慢病毒载体,利用测序鉴定序列是否连接成功;通过RNAi技术,将构建成功的重组质粒包装成慢病毒并侵染细胞,建立敲低TFEB的细胞系,利用Western blot检测侵染及对照HeLa细胞TFEB蛋白表达水平。结果:测序结果显示pLKO.1-TFEB-shRNA重组质粒分别包含3U、OR不同干扰序列,重组质粒构建成功;Western blot检测结果表明,序列为3U和OR的慢病毒收集液侵染的细胞内TFEB表达量均降低。结论:利用序列为3U和OR的shRNA构建的重组质粒、包装的慢病毒均成功,干扰了侵染获得的细胞系中TFEB的表达。

靶向RelA(p65)基因shRNA慢病毒载体构建及功能鉴定

目的构建靶向RelA(p65)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并对其功能进行验证。方法设计3对针对RelA基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落聚合酶链式反应(PCR)及测序鉴定,将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定,通过Western blot实验筛选出对HepG2细胞株中RelA基因干扰效果最好的慢病毒,并通过CCK-8检测Lenti-shRelA对细胞增殖活性的影响。结果测序结果显示重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示重组慢病毒载体构建成功。重组慢病毒Y4056、Y21318、Y21319、Y21320的滴度分别为3.13×10^(8)TU/ml、2.97×10^(8)TU/ml、2.51×10^(8)TU/ml、3.40×10^(8)TU/ml。用慢病毒Lenti-shRelA(Y21318、Y21319、Y21320、Y4056)感染HepG2细胞,Western blot实验结果显示Y21320对HepG2细胞株中RelA基因的干扰效果最好。CCK-8实验结果显示RelA的敲降可显著抑制细胞增殖活力。结论该研究成功构建了靶向RelA基因shRNA慢病毒载体,其能有效下调HepG2细胞RelA的表达并抑制细胞增殖,为进一步研究RelA在肝癌发生、发展中的机制奠定了基础。

Survivin shRNA和APC片段双基因的载体构建及其在HT-29细胞的表达

目的研究表明APC、Survivin 2种基因表达异常在结肠癌的发生发展中具有重要意义。构建Survivin shRNA、APC功能片段双基因共表达慢病毒载体并观察其能否于HT-29结肠癌细胞中成功表达,同时观察其是否能够对结肠癌细胞凋亡产生影响。方法构建3对互补Survivin shRNA片段,从其中筛选出一条最佳干扰shRNA片段,与APC功能片段(aa1020-1698)相连接构建双基因共表达质粒载体。将HT-29细胞分为实验组、空载组、空白组3组,慢病毒对HT-29进行侵染,观察是否有绿色荧光表达及对转染细胞进行realtime PCR、Western blot检测Survivin、APC基因表达水平。通过检测Caspase-3活性来检测细胞凋亡情况。结果 1Real time PCR检测后显示对Survivin基因起到最佳干扰效果的片段为shRNA3序列。2构建出的shRNA载体经过送序验证比对后,3对shRNA序列与最初设计的序列完全相同。在HT-29细胞中可见绿色荧光,实验组Survivin相对含量(31.71±1.49)较空载组(100±0)、空白组(95.12±2.15)明显减少(P<0.05),APC mRNA表达水平较空载组(0±0)、空白组(0.51±0.15)明显增加(P<0.05)。实验组Survivin蛋白相对含量(0.18±0.01)较空白组(0.24±0.04)、空载组(0.22±0.03)明显减少,APC蛋白表达水平(0.147±0.016)较空白组(0.095±0.012)、空载组(0.108±0.015)明显升高(P<0.05)。3实验组凋亡相对比值(0.573±0.050)较空白组(0.390±0.040)、空载组(0.407±0.030)明显增加(P<0.05)。结论成功构建Survivin-shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体,并能够在HT-29结肠癌细胞中成功表达,该双基因共表达载体可为后续利用该载体进行基因治疗的基础实验提供材料。

SurvivinshRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长情况的影响

目的在转录后水平进行干预的RNA干扰技术在多基因治疗中的应用越来越广泛。文中旨在构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过联合RNAi和外源性补充的方式研究Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对结肠癌裸鼠移植瘤生长情况的影响。方法选取35只裸鼠随机数字表法分为5组,即Survivin shRNA-APC双基因组、Survivin shRNA组、APC组、空载组和空白组,每组7只;将已经构建好的处于对数生长期的双基因共表达Survivin shRNA-APC、Survivin shRNA及APC稳转株,空载稳转株,HT-29结肠癌细胞(均为2×106/mL)分别注射至5组裸鼠左前腋下成瘤,构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型;通过测量瘤体体积、重量,检测移植瘤生长抑制率,Real time PCR检测移植瘤组织survivin mRNA的表达,免疫组化检测Survivin蛋白的表达,TUNEL检测凋亡情况。结果与空白组比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组移植瘤平均体积、平均重量均减少(P<0.05);与空载组比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组平均体积、平均移植瘤重量亦减少(P<0.05),而体积抑制率、瘤重抑制率均增加(P<0.05);与双基因组比较,APC组、Survivin shRNA组移植瘤平均体积、平均重量均增加(P<0.05)。与空白组和空载组相比,APC组、Survivin shRNA组、Survivin shRNA-APC双基因组移植瘤组织Survivin mRNA和蛋白表达相对含量明显降低(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC组相比,双基因组移植瘤组织Survivin mRNA和蛋白表达相对含量亦明显降低(P<0.05)。与空白组裸鼠移植瘤组织结肠癌细胞凋亡指数[(9.89±0.31)%]比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组[(31.19±1.79)%、(33.64±2.03)%、(56.72±3.17)%]明显升高(P<0.05),而APC组、Survivin shRNA组、双基因组亦较空载组[(10.06±0.43)%]明显升高(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC组相比,Survivin shRNA-APC双基因组移植瘤组织癌细胞凋亡指数明显升高(P<0.05)。结论 Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体能够使Survivin基因的表达水平降低,促进结肠癌细胞的凋亡,抑制移植瘤的生长,且优于单个基因的影响。

Smad3 shRNA抑制TGFβ1对HSC-T6细胞活化的抗肝纤维化作用

目的观察Smad3 shRNA对TGFβ1作用于大鼠HSC-T6细胞增殖、细胞周期以及分泌肝纤维化胶原的影响。方法Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6,应用流式细胞仪检测其感染率,Real-time PCR检测对Smad3 mRNA表达的抑制作用;将HSC-T6对照、HSC-T6+TGFβ1(10 ng/ml)、Smad3 shRNA以及Smad3 shRNA+TGFβ1(10 ng/ml)这4组细胞进行如下检测:(1)MTT检测细胞增殖;(2)流式细胞仪检测TGFβ1作用24、36 h细胞周期分布;(3)Real-time PCR检测24、36 h时细胞周期、增殖及肝纤维化相关基因mRNA的表达变化;(4)ELISA检测24、36 h培养液上清中胶原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢ及α-SMA的含量。结果Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6细胞至96 h,感染率为71.3%,对Smad3 mRNA的表达抑制率为50%。(1)MTT结果显示,TGFβ1促进HSC-T6增殖;与相应未感染Smad3 shRNA病毒组相比,Smad3 shRNA组以及Smad3 shRNA+TGFβ1组细胞增殖能力均下降。(2)细胞周期检测发现,24、36 h时,Smad3 shRNA+TGFβ1组与Smad3 shRNA组相比,细胞周期分布差异无统计学意义(P>0.05);(3)Real-time PCR显示,Smad3 shRNA+TGFβ1组较HSC-T6+TGFβ1组,Smad3、原癌基因(c-myc)、细胞周期依赖性激酶-2(CDK-2)、细胞周期素E(cyclin E)、表皮生长因子(EGF)、核因子-κB(NF-κB)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、COLⅠ及基质金属蛋白酶(MMP)14等基因的mRNA在24、36 h表达均下调,HGF mRNA及COLⅢmRNA在24 h时上调、36 h时下调,Bcl-2 mRNA、MMP1 mRNA及MMP9 mRNA在24 h和36 h两个时段均表达上调。(4)ELISA检测发现,同一时间点比较,分别在24、36 h,TGFβ1可促进HSC-T6细胞COLⅠ(P=0.00,P=0.02)、α-SMA(P=0.00,P=0.01)的分泌;与HSC-T6+TGFβ1组相比,Smad3 shRNA+TGFβ1组COLⅠ于36 h分泌减少(P=0.00)、而α-SMA在24、36 h两个时间点分泌减少(P=0.00)。结论 Smad3 shRNA抑制了TGFβ1对HSC-T6的活化,显示了抗肝纤维化作用。

西农萨能羊FAS基因shRNA序列筛选及其腺病毒载体的构建

山羊脂肪酸合酶（Fatty acid synthase,FAS）是脂肪酸合成的关键酶,对乳腺短、中链脂肪酸合成起重要调控作用。设计了shRNA-5544、shRNA-5936s、hRNA-6132 3条针对FAS基因不同区域的小发夹RNA（Short hairpin RNA,shRNA）及一条阴性对照序列shRNA-NC,并构建表达这4条shRNA序列的入门载体及其靶基因与红色荧光蛋白基因的融合表达载体,二者共转染HEK 293细胞进行有效序列筛选,结果显示shRNA-5544和shRNA-5936序列具有明显的干扰效果。在LR Clonase-Ⅱ重组酶作用下,分别将pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5544、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-5936及pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC入门载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST进行LR重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后成功获得3个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切鉴定及测序分析证实所构建的重组腺病毒载体中插入序列与设计序列一致。重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,利用Lipofectamine 2000转染HEK 293细胞,10~12 d后收集病毒,在HEK 293细胞中反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,利用TCID50法测定重组腺病毒滴度分别为6×108PFU/mL（表达shRNA-5544序列）、5×108PFU/mL（表达shRNA-5936序列）及6×108PFU/mL（表达shRNA-NC序列）,为进一步在原代培养的山羊乳腺上皮细胞中进行FAS基因的RNA干扰研究奠定基础。

水牛YY1基因克隆及其shRNA片段的筛选

本试验旨在克隆水牛阴阳因子1(YY1)基因,并筛选获得可有效抑制水牛YY1基因表达的shRNA干扰片段。以水牛成纤维细胞cDNA为模板,采用RT-PCR方法,扩增水牛YY1基因CDS序列,将其连接插入到pMD18-T载体中,进行序列测序并分析。采用Xho I和EcoR I双酶切,将水牛YY1基因编码区定向克隆至pEGFP-N1载体中,构建其真核表达载体pYY1-EGFP-N1。设计2条靶向水牛YY1基因的shRNA序列并构建其慢病毒表达载体,命名为pSicoR-GFP-YY1 shRNA1/2。以pSicoR-GFP和pSieoR-GFP-1864分别为空白对照和阴性对照质粒,采用脂质体转染方法,将YY1真核表达载体分别与2条shRNA慢病毒表达载体共转染293T细胞,48h后观察绿色荧光蛋白EGFP表达情况;72h收集共转染细胞样品,采用qRT-PCR和western-blot方法分析YY1基因的表达水平。结果表明,克隆得到1248 bp的水牛YY1基因CDS序列,其与牛YY1基因的同源性达99%。构建的水牛YY1基因真核表达载体pYY1-EGFP-N1能在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)中瞬时表达。酶切分析及序列测定结果表明,所构建的shRNA慢病毒表达载体pSieoR-GFP-YY1 shRNA1/2为阳性克隆。质粒共转染293T细胞48h后,可观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达。qRT-PCR结果显示,设计合成的2条shRNA对水牛YY1基因的表达均有抑制效果,其中YY1 shRNA2的抑制效果(93.64%)显著高于YY1 shRNA1(50.77%)(P<0.05),Western-blot分析结果显示,2条shRNA对YY1蛋白表达均有抑制效果。以上结果说明克隆得到水牛YY1基因编码区序列,并获得2条有效抑制其表达的shRNA片段,为进一步阐明YY1基因在水牛早期胚胎发育过程中的作用奠定了基础。

shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpinRNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducibleFactor-1,HIF1)基因的沉默效果。方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1。以人HIF1cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1。新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变。结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义。

慢病毒介导shRNA靶向ZNF217抑制胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭

目的探讨癌基因ZNF217对胶质瘤U251细胞迁移、侵袭以及增值的影响以及相应的分子机制。方法构建shRNAZNF217慢病毒干扰载体,在将其包装成成熟的慢病毒后感染胶质瘤U251细胞。Western blot检测ZNF217干扰效率。利用transwell、Boyden、MTT和流式细胞仪分别检测细胞迁移、侵袭、增殖以及细胞周期能力的改变。western blot检测相应基因表达改变。结果与对照细胞相比,ZNF217基因在慢病毒shRNA-ZNF217作用下,其表达水平在胶质瘤U251细胞中显著下调。Transwell和Boyden结果显示,在抑制ZNF217表达后细胞迁移和侵袭能力也明显下降。此外,MTT和流式细胞仪分析结果表明,细胞的增值和周期转化能力也明显降低。机制分析显示,在抑制ZNF271表达后,磷酸化的PI3K/AKT以及癌基因C-Myc和间质标志物N-Cadherin活性减低,而上皮标志物E-Cadherin活性增高。结论 ZNF217在胶质瘤中通过激活PI3K/AKT上调CMyc基因以及调控上皮向间质转化相关基因(Epithelial–mesenchymal transition EMT)从而促进细胞生长、迁移和侵袭。

ShRNA表达载体干涉Cyclin D1分子抑制骨肉瘤细胞系SOSP-9607的增殖

目的:探讨Cyclin D1 shRNA(short hairpin RNA)对骨肉瘤细胞系SOSP-9607增殖和凋亡的影响。方法:利用Cy-clin D1 shRNA表达载体,稳定转染骨肉瘤细胞系SOSP-9607,分别采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA水平和蛋白水平上检测CyclinD1的变化;流式细胞术检测骨肉瘤细胞Cyc-linD1周期和凋亡率的变化;CCK-8检测干涉Cyclin D1对骨肉瘤细胞增殖的影响。结果:稳定转染Cyclin D1 shRNA载体后骨肉瘤细胞的Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达均被明显抑制。与对照组相比,骨肉瘤细胞增殖被显著抑制(P<0.05)。同时,细胞发生G0/1期阻滞,G1/S期比例增加(P<0.01)。结论:Cyclin D1 shRNA载体可下调目的基因的表达,有效的抑制骨肉瘤细胞SOSP-9607的增殖,发生G1/S期阻滞。

shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK的表达及细胞迁移和侵袭

目的:研究shRNA对小鼠肝癌细胞株Hca-F JNK基因表达的抑制作用及对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,阐明JNK表达水平与小鼠肝癌细胞淋巴转移潜能的关系。方法:构建3条shRNA表达载体,以脂质体法稳定转染Hca-F细胞;RT-PCR和Western blotting检测shRNA对JNK基因和蛋白表达的抑制作用,筛选出RNA干扰效果最好的shRNA;Transwell实验检测Hca-F细胞穿膜细胞数观察shRNA对Hca-F细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。结果:成功构建pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞,筛选出对JNK表达抑制效果最好的shRNA;其转染后JNK mRNA表达水平与其他组比较明显下调(P<0.01);JNK蛋白质表达水平与其他组比较明显减少(P<0.01);转染shRNA后Hca-F细胞穿膜细胞数均显著下降(P<0.05)。结论:通过建立pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞株,获得JNK表达稳定下调的Hca-F细胞株,抑制JNK表达水平可降低小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭能力,JNK可能是决定肝癌淋巴转移潜能的重要基因之一。

shRNA沉默ROCK1和ROCK2表达对缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨Rho相关的卷曲蛋白激酶(ROCK1)和ROCK2在缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法:原代培养大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。将ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染细胞,48 h后给予缺氧6 h处理。实验分为5组:(1)空白对照组;(2)缺氧组;(3)缺氧+阴性对照shRNA组;(4)缺氧+ROCK1-shRNA组;(5)缺氧+ROCK2-shRNA组。用倒置显微镜观察心肌细胞搏动频率与节律;用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量;用MTT检测细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡率;用Western blotting检测ROCK1和ROCK2的表达,并检测caspase-3和p-PI3K的表达情况。结果:鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。缺氧损伤后心肌细胞搏动频率较对照组明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。全自动生化分析仪检测发现,缺氧能导致细胞培养液LDH含量升高(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.01)。MTT检测发现,缺氧能导致心肌细胞存活率降低(P<0.05),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05)。流式细胞仪检测发现,缺氧能导致心肌细胞凋亡率升高(P<0.01),而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。Western blotting检测发现,ROCK1-shRNA的转染能降低ROCK1的表达(P<0.05),ROCK2-shRNA的转染能降低ROCK2的表达(P<0.01);缺氧能导致caspase-3表达升高(P<0.05)、p-PI3K表达降低(P<0.01),ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用(P<0.05或P<0.01)。结论:ROCK1和ROCK2表达下调能抑制缺氧损伤导致的大鼠心肌细胞凋亡,其机制与抑制caspase-3活化和增强p-PI3K的表达有关。

靶向 survivin 基因的 shRNA 慢病毒载体的构建及其对膀胱癌 EJ 细胞凋亡的影响

目的:构建survivin基因特异性shRNA慢病毒干扰载体,转染膀胱癌EJ细胞,研究survivin基因在膀胱癌细胞株中的表达抑制情况,观察survivin shRNA慢病毒载体对EJ细胞凋亡的影响.方法:以survivin基因为靶标设计shRNA干扰序列,克隆至p SIH1-H1-cop GFP慢病毒载体.干扰载体鉴定正确后转染膀胱癌细胞株EJ细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,实时荧光定量PCR检测survivin基因mRNA含量变化,Western blotting法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测EJ细胞凋亡情况.结果:PCR扩增鉴定、DNA测序证实survivin慢病毒干扰载体构建成功;EJ细胞经干扰载体处理后,EJ细胞survivin基因mRNA水平下调了73.33%,蛋白表达受到显著抑制,EJ细胞凋亡率达到24.39%.结论:成功构建了靶向survivin基因的shRNA重组慢病毒干扰载体,可以显著降低转染细胞survivin基因的表达水平,并有效提高膀胱癌细胞凋亡率.

逆转录病毒载体介导shRNA对人胚胎肾细胞中p53基因的沉默作用

目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人野生型p53基因设计的shRNA被连接在H1启动子的下游,构建含有shRNA的逆转录病毒载体LTRH1-p53,即RNAi表达载体;利用流式细胞术检测逆转录病毒感染HEK293细胞72 h后细胞内P53蛋白水平的变化。结果:成功构建LTRH1-p53载体,该载体感染HEK293细胞后72 h,与感染空病毒载体LTRH1组相比,P53蛋白表达降至空病毒载体LTRH1组的69%(P<0.01)。结论:LTRH1-p53表达载体成功使p53基因沉默,shRNA表达载体的使用为基因功能研究提供有力工具。

shRNA下调Paxillin表达对SMMC-7721肝癌细胞增殖、侵袭的影响

目的采用RNA干扰技术转染shRNA下调SMMC-7721肝癌细胞中Paxillin的表达,探讨Paxillin下调对SMMC-7721细胞迁移、侵袭力的影响。方法采用Paxillin shRNA转染肝癌细胞株SMMC-7721,分别设未处理SMMC-7721肝癌细胞组(未处理组)、shRNA Paxillin阴性组(对照组)和shRNA Paxillin组(实验组)。以GAPDH为内参,采用qRT-PCR、Western blot、ELISA法分别检测各组SMMC-7721细胞中Paxillin与FAK的表达;筛选出稳定转染Paxillin shRNA的肝癌细胞株,采用MTT、Transwell侵袭小室法分别检测各组细胞的增殖情况和侵袭力差异。结果 qRT-PCR和ELISA结果均显示Paxillin表达明显下调(P<0.05),FAK表达各组间差异无显著性(P>0.05);Western blot法检测结果显示实验组Paxillin的相对表达量明显低于未处理组和对照组;成功构建Paxillin稳定表达的SMMC-7721肝癌细胞株;MTT细胞增殖与Transwell细胞侵袭力检测显示Paxillin下调肝癌细胞的增殖、侵袭能力明显低于未处理组和对照组(P<0.05)。结论 shRNA干扰技术可以下调Paxillin的表达;Paxillin表达下调抑制SMMC-7721肝癌细胞的增殖、侵袭能力;Paxillin有望成为肝癌复发、转移预测和基因治疗的新靶点。