PrP蛋白与Shadoo蛋白研究进展

朊蛋白(PrP蛋白)在传染性海绵状脑病中具有重要作用,但其生物学功能至今没有明确。Shadoo蛋白是一种与朊蛋白在N端结构上极为相似的新蛋白,SPRN是Shadoo蛋白的结构基因。由于Shadoo蛋白与PrP蛋白具有相同的生物学性质,且它们在脑组织中重叠表达,因此也被认为是研究朊蛋白的关键因素。文章主要探讨PrP蛋白与Shadoo蛋白在基因结构、蛋白功能、朊病毒感染方面的关系。

鸡朊样蛋白Shadoo的基因序列与结构特征分析

根据GenBank收录的鸡SPRN(ChSPRN)序列设计特异性引物,以鸡脑组织基因组DNA为模板,无菌采集10只青脚麻鸡脑组织,克隆鸡朊样蛋白Shadoo的基因(SPRN)并分析其序列与高级结构特征,并应用生物信息学方法与软件进行分析,探讨其与PrP(朊蛋白)之间的相互关系.结果表明:ChSPRN长354bp,在第23位与第56位发生G→A、C→T突变,分别对应氨基酸序列C→Y、P→S突变,与GenBank中收录的鸡SPRN序列相比,两者核苷酸序列同源性高达99.7%,推导氨基酸序列同源性为99.9%.分析氨基酸序列并利用同源法构建ChSho与ChPrP的三级结构,结果显示它们N-端同源性为44.25%,C-端结构相似性为23.33%;ChSho与ChPrP在核苷酸、RNA二级结构、氨基酸水平以及高级结构中表现出的惊人相似性,推测其与PrP具有相似功能.

SPRN^(0/0)型小鼠与C57BL/6野生鼠大脑中miRNAs的差异表达

应用荧光定量PCR及基因芯片技术,检测小分子RNA(microRNA,miRNA)在SPRN0/0型小鼠与C57BL/6野生鼠大脑中的差异表达,探讨SPRN基因敲除后小鼠大脑中miRNAs相对表达变化,对检测部分差异表达的miRNAs进行验证。结果表明:与正常标本相比,SPRN0/0型小鼠大脑中miR-135a、-24-2*、-146a、-7a、-380、-448、-128和-152的表达量均显著下调,其中miR-24-2*、-380、-448、-152均下调1/10以上,miR-135a、-146a、-7a均下调1/2以上。miRNAs的这些变化可能与Shadoo蛋白的生理功能有关。

SPRN0/0 型小鼠与C57BL／6野生型小鼠小脑中microRNA的差异表达

本试验通过实时荧光定量PCR方法来验证SPRN0/0型小鼠和C57BL/6野生型小鼠小脑中小分子RNA(microRNA)差异性表达,探讨SPRN基因敲除后小鼠小脑中microRNA相对表达变化。结果表明,与正常标本比,SPRN0/0型小鼠小脑中miR-135a、miR-24-2*、miR-146a、miR-7a、miR-380、miR-448、miR-128和miR-152的表达量均显著下调,其中miR-24-2*下调10倍以上,miR-448、miR-146a、miR-128、miR-380、miR-152均下调2倍以上,miR-135a和miR-7a均下调1倍。由此推断,microRNA的这些变化可能与Shadoo蛋白的生理功能有关,且microRNA靶基因的确立也可以为进一步研究Shadoo蛋白的生理功能提供新的思路。

小鼠朊蛋白相关蛋白Shadoo的表达、纯化及多克隆抗体的制备

构建SPRN重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备。提取BALB/c小鼠全血基因组,PCR扩增SPRN基因,克隆至融合表达载体,在大肠埃希菌中表达鼠Shadoo蛋白并纯化;以纯化蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,并检测抗体效价,用Western blot方法分别检测与重组及内源性Shadoo蛋白的反应性。结果表明,成功制备了小鼠Shadoo蛋白兔源多克隆抗体,为研究Shadoo蛋白与PrP蛋白之间的功能调节关系、自身的生理学作用以及Shadoo蛋白在传染性海绵状脑病发病机制过程中的生物学功能奠定了良好的基础。

朊蛋白相关蛋白Shadoo与朊病毒病

朊病毒病，即传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies, TSEs），是一类传染性、致死性神经退行性疾病。在朊病毒病的病理过程中，细胞正常朊蛋白PrP。转化为异常构象的PrP是至关重要的，但是PrP‘的正常生理功能仍不清楚。国外学者利用比较基因组学发现了-个新的朊蛋白相关蛋白-shadoo（Sho）。Sho与PrP。在氨基酸序列和细胞定位的相似性及主要在脑组织表达，使它成为-个非常值得研究的PrP相关蛋白。对Sho可能存在的与PrP。重叠的功能甚至直接相互作用的研究工作，将对今后揭示PrPc正常生理功能以及揭示Pfion病发病机制具有重要现实意义。