中药沪地龙的生产质量管理规范及研究

目的制定沪地龙生产质量管理规范(GAP)。方法按照我国中药材GAP规范化生产的综合技术要求,在上海市崇明区三星镇开展规范化养植和加工关键技术研究。结果明确规范了沪地龙的产地环境、品种特征、养殖技术、病虫害防治、采收加工、包装储藏运输、质量监测等技术环节。结论为沪地龙的标准化和现代化质量管理提供操作依据。

HPLC法测定各沪产地龙和广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶和尿苷的含量

目的测定各种沪产地龙与广地龙中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷的含量,建立地龙药材质量评价的方法。方法用0.9%生理盐水超声提取地龙,SORBAX SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm,Aglient Co.,Ltd）,流动相：5mmol/L磷酸二氢钾（pH 2.9）,流速1mL/min,检测波长254nm,柱温30℃,进样量10μL,采用HPLC法,同时测定次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷4种核苷类成分的含量。结果次黄嘌呤的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率99.37%,RSD=1.36%（n=6）;黄嘌呤的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.993 1）,平均回收率91.57%,RSD=1.40%（n=6）;尿嘧啶的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率95.31%,RSD=1.64%（n=6）;尿苷的线性范围为0.500 0-100.00μg（r=0.999 9）,平均回收率100.21%,RSD=1.98%（n=6）。结论该方法重复性、回收率好,可用于测定地龙与广地龙中次黄嘌呤等4种核苷类成分的含量。

提高沪地龙药材质量的加工方法研究

目的::研发一种高效的加工方法,以提高沪地龙药材质量。方法:自主研发机械化加工设备,并考察不同辅料(面粉、米糠、生石灰、木屑、草木灰)混合清洗,降低灰分含量的效果。结果:采用机械化加工设备加工的蚯蚓剖开率达95%以上。经过添加辅料清洗可以有效控制灰分含量,其中以草木灰或面粉为辅料清洗的药材灰分含量最低。结论:本研究采用自主研发的设备结合有效辅料清洗,创立了一种高效去除沪地龙灰分的加工方法,为解决同类问题提供了参考。

沪地龙3个基原的多重位点特异性PCR鉴别

目的沪地龙3个基原药材(通俗环毛蚓Pheretima vulgaris、威廉环毛蚓P.guillelmi、栉盲环毛蚓P.pectinifera)在外观性状方面相似度高,传统鉴定方法难以有效区分,通过建立多重位点特异性PCR方法同时鉴别沪地龙3个基原。方法通过比对沪地龙和其他7个蚯蚓品种线粒体全基因序列的多态性位点差异,分别设计通俗环毛蚓、威廉环毛蚓及栉盲环毛蚓的特异性鉴别引物,建立单基原反应体系,并对耐受性和适用性进行考察和验证;而后优化特异性引物组合,构建多重位点特异性PCR鉴别体系;反应体系为25μL:2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL,引物1.5μL(通俗环毛蚓∶威廉环毛蚓∶栉盲环毛蚓=1∶1.2∶0.8),DNA模板0.5μL(50 ng/μL),灭菌水补足至25μL。PCR扩增条件:95℃预变性4min;95℃变性15 s,60℃退火15 s,72℃延伸20 s,循环33次;产物末端72℃延伸7 min。结果通俗环毛蚓可得到535 bp条带,威廉环毛蚓可得到219 bp条带,栉盲环毛蚓可得到435 bp条带,其他品种蚯蚓样品均无条带。结论多重位点特异性PCR鉴别体系可根据条带位置同时鉴别沪地龙3个基原。该方法可用于沪地龙基原和真伪鉴别,并为地龙的质量控制和研究提供参考。

HPLC法测定沪地龙中7个核苷类成分的含量

目的:建立中药材沪地龙中7个核苷类成分的分析方法。方法:采用0.1%氨水超声提取沪地龙药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、2’-脱氧鸟苷,并应用反相高效液相色谱法测定其含量;色谱条件:采用Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以5 mmol·L^(-1)乙酸铵溶液和甲醇为流动相,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长254 nm,柱温30℃。结果:尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷和2’-脱氧鸟苷的线性范围分别为0.51~102.09μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.52~103.78μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.50~101.03μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.52~104.79μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.50~99.99μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.55~110.54μg·mL^(-1)(r=1.000 0),0.50~99.28μg·mL^(-1)(r=1.000 0);平均回收率(n=6)分别为98.6%(RSD=2.6%)、104.6%(RSD=1.8%)、105.3%(RSD=1.4%)、96.2%(RSD=2.6%)、91.0%(RSD=0.42%)、88.1%(RSD=2.1%)和106.5%(RSD=2.1%)。12批样品中上述7个核苷类成分的含量测定结果分别为0.046~0.864、0.263~0.770、0.034~0.631、0.379~0.994、1.655~3.595、0.544~1.465和0.074~0.208 mg·g^(-1)。结论:该方法可用于沪地龙药材中核苷类成分的含量测定。

地龙的HPLC特征图谱研究

目的:建立地龙的高效液相色谱(HPLC)特征图谱,比较广地龙与沪地龙的主要成分含量差异以及地龙与3种其他动物药的图谱差异。方法:采用地龙HPLC特征图谱法,测定了16份广地龙、8份沪地龙、3份土鳖虫、3份水蛭与3份蜣螂虫的特征图谱,采用相似度评价与t检验对这5种动物药的图谱数据进行差异分析。结果:本研究建立了地龙药材的HPLC特征图谱法,首次指认了11个共有特征峰,包括6个核苷、4个核碱基与1个氨基酸;建立的HPLC特征图谱法可以将地龙与土鳖虫、水蛭及蜣螂虫区分开来;首次对广地龙与沪地龙HPLC特征图谱中主要成分的含量差异进行了研究,其中广地龙中黄嘌呤及腺苷含量高于沪地龙,沪地龙中尿苷、鸟苷及2′-脱氧鸟苷含量高于广地龙,并据此计算出5种成分的峰面积比值新指标S,S值可用于区分2种地龙。结论:该特征图谱可用于地龙药材的鉴别,且可为广地龙与沪地龙的药效学差异研究提供参考。