体外功能性肺组织模型构建、调控及在肺纤维化和COVID-19中的应用

肺纤维化是很多肺部疾病发生发展过程中出现的病理现象。近年出现的2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019,COVID-19)引发的呼吸系统综合征也会出现弥漫性肺泡损伤,并诱发肺纤维化。因此,开展肺纤维化和COVID-19体外模型构建与调控研究在肺部疾病治疗和药物筛选方面意义重大。目前,现有研究已建立了多种体外肺组织二维、三维细胞培养模型,本文将全面概述这些模型的构建方法,并结合这些模型在肺纤维化及COVID-19中的应用研究,对体外肺组织模型在药物传递、高通量药物筛选及发病机制研究等生物医学领域中的应用前景进行综述,为其进一步研究提供参考。

人皮肤成纤维细胞与PGA进行组织构建的适宜接种浓度

目的可吸收生物材料聚羟乙酸(PGA)与成纤维细胞已被证实可以应用于体外组织工程肌腱的构建,本试验旨在探讨应用人皮肤成纤维细胞与PGA在体外进行组织构建时的适宜接种浓度。方法酶消化法获得人皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增至第2代,按照低、中、高三种浓度接种于PGA材料分别作为实验组1、2、3,传统浓度细胞接种的作为对照组,各组样本数n均为3,分别于接种后3天、1周、2周和4周进行观察和检测。结果接种后3天实验各组无明显差异,细胞在材料上黏附伸展良好。1周和2周时,各组细胞均有明显增殖,并分泌细胞外基质(ECM extra cellular matrix),但实验组1、2的ECM不如实验组3和对照组丰富,此后该现象更为明显。至第4周时,实验组1仅形成厚薄不均的薄膜状物,其余三组均形成组织样结构,但实验组2形成的细胞--材料复合物结构略为松散。结论应用本实验组中高浓度接种皮肤成纤维细胞在体外构建工程化组织可以达到传统所用更高浓度的接种效果,以节约细胞,减少取材。

针刀干预后颈椎病大鼠头夹肌成纤维细胞生长因子家族及其受体的表达

背景:针刀是治疗颈椎病的有效方法,临床疗效确切,但其关键分子机制尚不明晰。目的:观察针刀干预对颈椎病大鼠头夹肌成纤维细胞生长因子家族及其受体激酶插入域蛋白受体表达的影响,分析针刀治疗颈椎病的作用机制。方法:通过检索GEO数据库,获取符合该研究的芯片数据集GSE153761,采用生物信息学方法进行靶标初筛,然后进行动物实验。选取6月龄SPF级SD大鼠24只,随机均分为4组。模型组和针刀组大鼠采用动静力失衡性颈椎病造模方法制备颈椎病大鼠模型;假手术组不切断肌肉及韧带;针刀组造模成功后采用针刀干预,每周1次,共3次;并以正常大鼠作为对照。拍摄颈椎正侧位X射线片进行模型验证;旷场实验观察大鼠行为学变化;苏木精-伊红染色观察头夹肌病理结构;荧光定量PCR法和免疫组化法分别检测头夹肌成纤维细胞生长因子家族及其受体激酶插入域蛋白受体mRNA及蛋白的表达情况。结果与结论:①生物信息学结果表明成纤维细胞生长因子家族/激酶插入域蛋白受体是激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B上游的重要信号轴。②造模后大鼠椎间隙变窄,椎体前后缘、关节突骨质增生。③旷场实验中,造模后大鼠总距离、平均速度降低(P<0.05),总休息时间延长(P<0.05);治疗后针刀组大鼠总距离、平均速度大于模型组(P<0.05),总休息时间短于模型组(P<0.05)。④头夹肌病理提示颈肌受损,而针刀可改善颈肌劳损。⑤与正常组比较,模型组大鼠头夹肌成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子18和激酶插入域蛋白受体mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05);与模型组比较,针刀组以上指标均降低(P<0.05)。⑥结果说明,针刀可能通过调节成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子18及其受体激酶插入域蛋白受体的表达,修复劳损颈肌,从而改善椎间盘退变,这可能是针刀治疗颈椎病的关键靶点。

本刊组织构建栏目已出版“碱性成纤维细胞生长因子”研究的相关文章

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对犬牙龈成纤维细胞的影响陈欣戬,闫福华,钟泉,等.2009。

利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究

目的 利用胶原构建皮肤组织工程支架。 方法 用 Na2 S、弹性蛋白酶预处理胎牛皮得到胶原纤维 ;经蛋白酶 M降解胶原纤维后 ,0 .5 mol/ L 醋酸溶液溶解得到酸溶性胶原 ;再用蛋白酶 N处理上述酸溶性胶原 ,最终得到生物相容性良好的胶原溶液 ;将胶原溶液构建皮肤组织工程支架。通过 SDS- PAGE试验 ,分析酸溶性胶原分子量及基本结构 ;用皮肤组织工程支架材料包覆大鼠创面 ,观察创面愈合情况 ,研究支架材料对大鼠创伤愈合的影响 ;在支架材料上种植成纤维细胞 ,观察细胞扩增情况 ,以及支架材料对细胞移植影响。 结果 通过特异性蛋白酶 M处理得到的酸溶性胶原 ,显示典型的 型胶原 SDS- PAGE图谱 ;构建的皮肤组织工程支架呈多孔海绵状 ,孔径为 5 0～ 2 0 0 μm;在支架材料上种植成纤维细胞扩增情况良好 ;用于修复大鼠创面 ,具有促进创面愈合作用。 结论 酸溶性胶原经蛋白酶 N处理后 ,生物相容性良好 ,适合于皮肤组织工程支架的构建 ,并具有良好生物活性。

富血小板纤维蛋白诱导口腔缺损软组织的修复与再生

背景:口腔种植术区软组织量不足可能对创面愈合和后期美学修复带来不利影响。富血小板纤维蛋白能促进软组织缺损创面的愈合进程,但目前尚缺乏深入探讨其促进口腔软组织缺损修复的动物实验。目的:对比观察富血小板纤维蛋白和胶原生物膜修复新西兰兔硬腭软组织缺损的效果。方法:将54只新西兰兔随机分为3组,分别为富血小板纤维蛋白组、胶原膜组和空白对照组,每组18只。每只实验兔均于硬腭前部中份,分别距上颌后排门齿、左右硬腭黏膜边缘2 mm处以直径为5 mm的组织环切钻制备圆形软组织全层缺损区。富血小板纤维蛋白膜组、胶原膜组分别于缺损处植入自体富血小板纤维蛋白膜和胶原生物膜,空白对照组创面不予任何处理。在术后3,7,14,21,28,56 d对创面进行大体观察并作创面愈合率分析;术区取材后行苏木精-伊红染色、CD31免疫组织化学染色和Masson染色分别观察术区炎性反应、血管生成和胶原形成情况。结果与结论:(1)创面愈合率:富血小板纤维蛋白组创面愈合速度最快,且无明显瘢痕形成。术后3 d各组的创面愈合率无显著差异。术后7 d富血小板纤维蛋白组创面愈合率大于胶原膜组和空白对照组(P<0.05)。(2)炎性反应:术后3,7 d,富血小板纤维蛋白组炎性反应均小于胶原膜组和空白对照组(P<0.05);术后14,21,28,56 d,3组炎症情况差异无显著性意义。(3)新生血管评价以CD31平均吸光度值分析:术后7,14,21 d,富血小板纤维蛋白组CD31平均吸光度值高于胶原膜组和空白对照组(P<0.05)。(4)胶原纤维形成以平均吸光度值分析:术后7 d,富血小板纤维蛋白组胶原纤维平均吸光度值高于胶原膜组和空白对照组(P<0.05);术后14 d,富血小板纤维蛋白组胶原纤维平均吸光度值高于空白对照组(P<0.05);术后21,28,56 d,富血小板纤维蛋白组胶原纤维平均吸光度值低于其他2组(P<0.05)。结果证实,富血小板纤维蛋白能减轻创面愈合过程中的炎性反应,加快血管化进程,调节胶原代谢,减少瘢痕形成,改善创面愈合质量,促进口腔软组织缺损修复。

肥厚腰椎黄韧带中成纤维细胞生长因子、转化生长因子及结缔组织生长因子的表达

背景:腰椎黄韧带肥厚是临床上引起腰椎管狭窄的主要因素之一,但其分子机制仍不是非常清楚。目的:分析纤维化相关细胞因子碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1和结缔组织生长因子在腰椎黄韧带肥厚过程中的作用。方法:取临床手术所取黄韧带,对照组6例(椎管内占位且无腰椎不稳患者黄韧带)、突出组(单纯腰椎间盘突出症患者黄韧带)6例、腰椎管狭窄症组6例。采用实时定量RT-PCR的方法检测各组黄韧带中碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1、结缔组织生长因子及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原蛋白的mR NA含量,分析3个细胞因子在黄韧带肥厚过程中的作用。结果与结论:腰椎管狭窄症组碱性成纤维细胞生长因子mR NA表达均明显高于突出组和对照组(均P<0.05);腰椎管狭窄症组转化生长因子β1 m RNA在3组中的表达明显高于对照组和突出组(均P<0.01);结缔组织生长因子mR NA 3组间差异无显著性意义(P>0.05)。腰椎管狭窄症组Ⅰ型胶原蛋白mR NA表达明显高于突出组和对照组(均P<0.05);Ⅲ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白mR NA表达3组之间差异无显著性意义(P>0.05)。结果说明碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1在腰椎黄韧带肥厚形成过程中有重要作用,引起黄韧带肥厚的主要胶原产物为Ⅰ型胶原蛋白。

富血小板纤维蛋白新生诱导骨的组织学观察

背景:作者在前期的实验中已证实富血小板纤维蛋白具有成骨性,并在微观结构和生物力学等方面进行了初步研究,但是对组织学上的研究较少。目的:对比观察富血小板纤维蛋白、Bio-Oss、自体骨3种不同骨替代材料植入后的组织学变化,分析富血小板纤维蛋白修复骨缺损的特点和优势。方法:12只beagle犬,参照文献方法建立犬双侧股骨髁左右各3个实验性临界性骨缺损动物模型。在3个骨缺损区随机分别填入自体富血小板纤维蛋白组,自体骨+胶原膜(自体骨组),Bio-Oss+胶原膜组(Bio-Oss组)。在植入后3,6,8和12个月分别处死3只实验犬,术区取材后进行组织学染色观察。另外1只实验动物按照上述方法制造临界性骨缺损模型后,不植入任何材料,标记为空白组。结果与结论:植入后3,6,8和12个月时,3种骨移植材料的新骨生成速度、生成量差异均有显著性意义。3种材料均能诱导成骨,但是成骨能力各不相同:富血小板纤维蛋白组在3个月和6个月时成骨效果更优,且形成的新骨更接近生理状态;自体骨在植入后3个月和6个月更多以骨坏死为主,8个月后成骨效果可,12个月后基本接近生理状态;Bio-Oss组成骨效果与富血小板纤维蛋白组类似,在12个月时仍可见Bio-Oss残留颗粒;空白组在术后3个月时未见明显新骨形成,说明该实验动物临界性骨缺损模型建立成功。实验结果显示富血小板纤维蛋白具有较好的诱导新骨形成的能力,且新骨形成所需时间更短,质量佳。

构建大鼠肝纤维化模型并观察大豆磷脂的保护作用

目的：目前认为肝纤维化尚存在可逆性。实验以光镜和细胞图像胶原半定量手段进一步验证大豆磷脂干预复合病因诱导肝纤维化大鼠模型肝细胞的组织学变化特点。方法：实验于2004-10/2007-05在辽宁医学院科学实验中心完成。①实验材料及分组：健康雄性SD大鼠24只，体质量180～220g。随机分为3组，即对照组、模型组、大豆磷脂组，每组8只。②实验过程：模型组采用复合病因诱导大鼠肝纤维化（给预高脂低蛋白食物和饮乙醇，皮下注射四氯化碳），大豆磷脂组给予造模饮食水，同时给予大豆磷脂300mg/（kg·d）灌胃，正常对照组给予大鼠正常饮食水。42d后麻醉下断颈处死大鼠。③实验评估：验证模型是否成功：采用光镜观察肝组织病理学改变；并用细胞图像分析仪对肝纤维化进行半定量分析；检测各组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、单胺氧化酶活性。实验过程对动物的处置符合动物伦理学标准。结果：①造模结果：6周末验证大鼠肝纤维化模型造模成功。②光镜观察组织学变化：苏木精-伊红染色可见模型组正常肝小叶已经被破坏，坏死区中央或周围有炎性细胞浸润。肝窦多受压变窄或闭塞。门脉区有大量成纤维细胞、纤维细胞和增生的胶原纤维，纤维组织相互环绕形成大量假小叶。MASSON染色可见模型组肝组织形成了较宽的以胶原纤维为主要成分的纤维间隔（绿色），胶原纤维分隔、包绕肝小叶，多数形成假小叶。大豆磷脂组上述变化较轻。③细胞图像胶原半定量测定结果：模型组、大豆磷脂组肝组织胶原纤维面积密度显著高于正常对照组（P〈0．01），而大豆磷脂组的指标显著低于模型组（P〈0．01）。④血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及单胺氧化酶活性：模型组和大豆磷脂组高于正常对照组（P〈0．01），但大豆磷脂组的指标低于模型组（P〈0．01）。结论：大豆磷脂干预肝纤维化大鼠后肝模型血清酶活性比模型组明显下降，胶原积累程度半定量分析也验证了干预后胶原纤维密度低于模型组，说明干预修复了受损的肝细胞。

贵州小型香猪皮肤成纤维细胞库的构建

目的:小型猪与人的皮肤组织结构相似,探索一种贵州小型香猪成纤维细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定方法为组织工程皮肤的构建奠定基础。方法:采用细胞培养技术和组织工程学方法。结果:采用细胞培养技术将贵州小型香猪成纤维细胞传代至23代,此时的细胞数至少是原代培养的细胞数的1×109倍,经冻存、复苏后,猪成纤维细胞仍具有增殖能力,生长状态与原代培养的猪成纤维细胞相类似。结论:通过细胞培养技术和组织工程学的方法可以成功地构建贵州小型香猪成纤维细胞库。

组织工程椎间盘纤维环:如何更接近于天然

背景:组织工程椎间盘为椎间盘退行性变疾病的生物治疗提供了新的方法,组织工程纤维环是构建组织工程椎间盘的关键之一。目的:从纤维环结构特点、材料支架、种子细胞3方面,归纳总结组织工程纤维环的研究进展。方法:用计算机检索Pub Med、万方数据库,限定时间为2000至2015年,中英文检索词分别为"组织工程,椎间盘,纤维环,种子细胞,支架材料,构建"和"tissue engineering,intervertebral disc,annulus fibrosus,seed cell,scaffold,construction"。按纳入和排除标准对文献进行筛选,保留48篇文章进行综述。结果与结论:早期的组织工程纤维环的研究仅侧重于支架上的细胞黏附、细胞增殖和细胞外基质的分泌,目前的组织工程纤维环可以在细胞功能、组织结构和力学特点等方面比较接近于天然纤维环,在动物实验中取得了一定的成果。但是以目前的材料和技术,要构建完全类似于天然纤维环的组织工程纤维环仍具有一定的难度,支架材料、培养条件、种子细胞的获取等诸多方面仍需要进一步完善。目前的构建策略主要集中在单相的纤维环支架上,双相纤维环及完整椎间盘支架将是研究的趋势。干细胞的诱导分化技术为组织工程纤维环提供了广阔的种子细胞来源。

构建肿瘤坏死因子α刺激基因6慢病毒表达及干扰载体及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响

背景:研究表明,肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumor necrosis factorαstimulated gene 6,TSG-6)具有抗炎作用,早期创面局部注射TSG-6蛋白可抑制瘢痕形成,但其参与瘢痕形成的机制尚不明确。目的:构建人TSG-6重组慢病毒表达载体与干扰载体,建立稳定转染的过表达及干扰细胞株,观察TSG-6对瘢痕疙瘩成纤维细胞株增殖与凋亡的影响。方法:采用酶消化法分离纯化得到人瘢痕疙瘩成纤维细胞,再以免疫组织化学法鉴定。构建p LVX-puro-TSG-6及pL VX-shR NA1-TSG-6重组慢病毒载体,感染人瘢痕疙瘩成纤维细胞,并行RT-PCR和Western blot检验各组细胞中TSG-6的表达。用MTT法和流式细胞术检测转染后不同时间段内各组细胞增殖和凋亡情况。用Western blot检测各组细胞中Bcl-2、P53及Active-caspase-3的表达。结果与结论:(1)成功分离原代人瘢痕疙瘩成纤维细胞,光学显微镜下细胞多呈梭形,传至5代后行波形蛋白的免疫组织化学染色,阳性率为100%,细胞角蛋白染色阴性;(2)重组慢病毒载体及稳定转染细胞株构建成功,细胞中TSG-6的表达发生明显变化。与对照组相比,TSG-6过表达组细胞增殖减缓,凋亡率显著升高,TSG-6干扰组细胞增殖加快,细胞凋亡率降低(P<0.05);(3)Western blot结果显示,TSG-6过表达组Bcl-2表达显著降低,P53及Active-caspase-3明显上升(P<0.05);(4)结果表明,TSG-6对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用,且其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达、上调P53蛋白表达、升高Caspase-3活性有关。

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脑血肿周围组织和海马bax及bcl-2基因表达的调节

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脑出血后出血灶周围脑组织和出血侧海马bax、bcl-2基因表达的影响,探讨神经营养因子对神经细胞调亡的调控。方法:实验于2006-01/10在广西医科大学医学科学实验中心完成。①取成年清洁级Wistar大鼠72只,雌雄各半,体质量250g左右。②采用脑内囊注射胶原酶建立大鼠脑出血模型,动物于苏醒后按Bederson法进行神经病学评分,评分>3分后入选本实验,入选72只大鼠随机抽签法分为3组,每组24只。碱性成纤维细胞生长因子组按8μg/kg剂量肌肉注射,1次/d;生理盐水组肌肉注射等剂量的生理盐水,1次/d;模型组不作任何干预。③每组分别于干预后1,3,7d随机抽取8只大鼠,麻醉状态下取出血灶周围脑组织和出血侧海马,采用半定量反转录-聚合酶链反应检测调亡调控基因bax mRNA,bcl-2mRNA的表达。结果:在建立脑出血模型中共5只大鼠死亡,随后对死亡动物进行解剖,发现脑内血肿量过大,致脑疝形成而导致死亡,后随机补充动物。72只大鼠进入结果分析。①血肿周围脑组织bax mRNA表达:干预后3d,7d,碱性成纤维细胞生长因子组血肿周围脑组织bax mRNA表达比生理盐水组明显减少(3d:0.54±0.19,0.76±0.23,P<0.05;7d:0.45±0.19,0.71±0.16,P<0.01)。②血肿周围脑组织bcl-2mRNA表达:干预后3d,7d,碱性成纤维细胞生长因子组的血肿周围脑组织bcl-2mRNA表达比生理盐水组明显增高(3d:0.68±0.25,0.39±0.19,P<0.05;7d:0.80±0.21,0.48±0.18,P<0.01)。③出血侧海马bax mRNA表达:干预后3d和7d,碱性成纤维细胞生长因子组的出血侧海马bax mRNA表达比生理盐水组均明显减少(3d:0.54±0.18,0.70±0.11;7d:0.43±0.24,0.69±0.18,P均<0.05)。④出血侧海马bcl-2mRNA表达:干预后3d和7d,碱性成纤维细胞生长因子组的出血侧海马bcl-2mRNA表达比生理盐水组均明显增多(3d:0.66±0.11,0.50±0.15;7d:0.72±0.12,0.52±0.22,P均<0.05)。结论:碱性成纤维细胞生长因子能调节凋亡相关基因,提高大鼠脑出血后大脑脑组织和海马bcl-2mRNA的表达,降低bax mRNA的表达。

组织工程椎间盘纤维环支架的研究进展

背景:组织工程为椎间盘退行性病变治疗提供了新的治疗方法。目的:综述了组织工程椎间盘纤维环支架的种类及构建纤维环支架的不同方法。方法:应用计算机检索CNKI和PubMed数据库中1988/2011关于组织工程纤维环支架的文章,在标题和摘要中以"组织工程;椎间盘;支架;纤维环;构建;综述"或"tissue engineering,intervertebral disc,scaffold,annulus fibrosus,construction"为检索词进行检索。结果与结论:纤维环支架是椎间盘组织工程构建的关键,其相关研究尚处于初期阶段。纤维环支架材料有两大类:蚕丝、藻酸盐等天然生物材料;聚氨酯、聚羟基乙酸和聚乳酸及纳米纤维等人工合成材料;支架材料种类繁多,各有利弊。目前用于纤维环支架的构建的方法有致孔剂法、湿纺技术及静电纺丝法。构建的纤维环支架结构与椎间盘纤维环自然结构还有一定差距,目前的方法制作单纤维层比较容易实现,复层纤维环的构建还存在技术的问题,单纤维层的抗拉强度仍然达不到自然结构的标准。因此优化纤维环支架构建方法、固定纤维环支架等方面还需要需进一步的实验研究。

大鼠成纤维细胞生长因子2分子克隆及其真核表达载体的构建

目的:实验旨在克隆大鼠成纤维细胞生长因子2CDS区基因全长,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建成纤维细胞生长因子2的真核表达载体。方法:实验于2007-03/06在苏州大学生物技术研究所完成。①实验材料:克隆载体PMD18-T-vector(takara);真核表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学第一附属医院消化科叶建新博士惠赠;大肠杆菌TOP10购自英俊公司;清洁级新生一两天SD大鼠2只。②实验过程及评估:体外分离培养新生SD大鼠心室肌细胞。Trizol法抽提心室肌细胞总mRNA,采用反转录-聚合酶链反应的方法反转录获得总的cDNA,聚合酶链反应的方法扩增成纤维细胞生长因子2基因的CDS区片断全长。将扩增出来的基因片断和克隆载体PMD18-T-vector连接,转化TOP10感受态细菌,阳性克隆经电泳,质粒聚合酶链反应和酶切等鉴定正确后送去测序确认。测序正确后抽重组质粒,bglⅡ和pstⅠ同时双酶切PMD18-T-FGF-2和PIRES2-EGFP,将切下的目的基因片段和线性PIRES2-EGFP空质粒载体在T4DNA连接酶作用下进行连接,构建其真核表达载体。结果:①成功培养出了形态典型的SD大鼠的心室肌细胞。②所获的大鼠成纤维细胞生长因子2DNA序列与GeneBank中收录的大鼠成纤维细胞生长因子2序列完全一致。③PIRES2-EGFP-bFGF真核表达载体的构建测序表明,成纤维生长因子2成功插入真核表达载体PIRES2-EGFP之中。结论:实验成功克隆了大鼠成纤维细胞生长因子2基因全长,并构建了其真核表达载体。为转基因细胞制备和移植治疗心肌梗死奠定基础。

骨髓间充质干细胞在软骨组织工程化组织构建中的应用

人骨髓中所含的细胞可以分为造血类细胞和非造血类细胞。前者中含有的干细胞主要为造血干细胞，而后者中含有间充质类干细胞（mesenchymal sten cell）能够分化为骨、软骨、肌腱、脂肪、皮肤和其他类型的细胞。骨髓中含有多向分化潜能的细胞，这类细胞的共同特征是具有成纤维细胞的形态，能黏附塑料培养皿，并能形成细胞克隆，但无吞噬功能。

周期性张应力下人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

背景:前期研究发现,周期性张应力在一定时间内可以诱导人牙周膜成纤维细胞增殖。目的:观察周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子的影响;明确JNK、p38MAPK、PI3K信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子过程中的作用。方法:采用多通道细胞牵张应力加载系统对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别给予周期性张应力刺激1,6,12,24 h,并以未加力组为对照组。对加力12 h的细胞分别添加JNK、p38MAPK、PI3K信号通路特异性抑制剂预处理,并与未加抑制剂的细胞作对比。应用ELISA法检测培养细胞分泌到上清液中的结缔组织生长因子蛋白;应用荧光定量PCR技术检测细胞结缔组织生长因子m RNA的表达。结果与结论:加载周期性张应力组与对照组相比较,1 h人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子开始增强、6 h表达明显增强,12 h达最高峰值、24 h表达开始下降。加入JNK信号通路特异性抑制剂后,人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子出现下降;而加入p38MAPK信号通路和PI3K信号通路的特异性抑制剂后结缔组织生长因子表达未发生明显改变。提示在一定时间范围内,周期性张应力引起结缔组织生长因子m RNA与蛋白水平的表达与时间呈依赖性升高;其后随着时间的延长,结缔组织生长因子的表达则开始下降。周期性张应力通过JNK通路的介导调控人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达。

构建组织工程化半月板:细胞、支架及生物因子

背景:自体或异体移植修复损伤的半月板治疗效果并不理想,应用组织工程化技术重建半月板的研究成为目前的研究热点。目的:探讨组织工程化技术修复重建损伤半月板的可行性。方法:对体外构建组织工程化半月板的种子细胞进行培养,并制备半月板支架材料,将种子细胞依附于支架材料上,利用细胞因子调控种子细胞的黏附、生长、分化和迁移,组织学检查细胞与支架的结合情况以及细胞的数量等。结果与结论:组织工程化半月板修复研究主要包括种子细胞、支架材料和细胞因子等方面。构建需要的种子细胞有骨髓间充质干细胞和半月板纤维软骨细胞,半月板纤维软骨细胞传至第3代可得出最佳效应浓度。对组织工程化半月板支架材料进行表面修饰,由多材料组成的复合材料具有更好的生物相容性。应用组织工程化技术修复重建损伤的半月板。

脐静脉内皮细胞低密度种植构建组织工程血管

背景:种子细胞来源不足是组织工程研究领域的难题之一,如何充分有效的利用有限的种子细胞,是一个值得深入研究的课题。目的:拟验证脐静脉内皮细胞低密度种植于脱细胞猪动脉支架实现血管内皮化的可行性。设计、时间及地点:观察性实验,于2006-10/2007-04在潍坊医学院生物化学实验室完成。材料:取新鲜猪颈动脉制备脱血管支架;新鲜脐带由潍坊人民医院产科提供,用于内皮细胞的分离和培养。方法:十二烷基硫酸钠和脱氧胆酸钠联合处理获取脱细胞猪动脉支架。0.1%胶原酶灌注获取脐静脉内皮细胞,光镜和免疫组织化学鉴定。分别将细胞以2×105cm-2低密度和2×106cm-2高密度种植于支架,静态培养11d。主要观察指标:DAPI染色法连续观察内皮细胞在支架上的生长情况。第11天对支架进行苏木精-伊红染色,扫描电镜观察,ELISA检测2×105cm-2低密度和2×106cm-2高密度培养液纤维连接蛋白的表达。结果:脱细胞支架细胞成分完全去除,胞外基质保存完好;细胞呈梭形或多角形,核仁清晰,呈典型的铺路石样;免疫荧光检测可见细胞胞浆内有颗粒状红色阳性信号。采用DAPI法连续动态观察内皮细胞在支架上生长良好,贴壁较好;苏木精-伊红染色显示支架表面形成连续融合单层细胞;扫描电镜可见内皮细胞单层形成,细胞呈多角形,椭圆形。低密度种植的培养液中纤维连接蛋白的表达量较高密度种植的高,分别为(121±7.93)μg/106个细胞和(78.20±3.21)μg/106个细胞,两者相比,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:脐静脉内皮细胞低密度种植于脱细胞猪动脉支架不仅可以实现血管内皮化,而且利于增强内皮细胞和细胞外基质黏附力,提高贴壁细胞的抗应切力。

淫羊藿苷诱导骨膜细胞增殖构建组织工程骨修复骨缺损

背景:淫羊藿苷有明确的诱导骨髓基质干细胞分化作用,但是对骨膜细胞诱导并用于动物实验报道较少。聚己内酯三维支架是一种新型的细胞培养三维支架,有可降解、孔径合适、组织相容性好的特点。目的:探讨淫羊藿苷对骨膜细胞的诱导增殖作用,构建骨膜细胞和三维支架复合体组织工程骨并研究其对兔桡骨缺损模型的修复作用,为骨缺损的治疗提供一种新的方式。方法:取兔下颌骨骨膜,组织块法获得原代骨膜细胞后,传代培养第3代并种植于24孔板。实验组分别用10-4,10^(-3)和10^(-2) mol/L的淫羊藿苷加入到相应培养孔中;对照组仅加入等体积的PBS;阳性对照组加入10μg/L碱性成纤维细胞生长因子。于第2,4,6和8天用MTT法检测不同组细胞吸光度值。将聚己内酯三维支架置于细胞培养板中,加入10-2 mol/L的淫羊藿苷及107 L-1的骨膜细胞联合培养,构建骨膜细胞三维支架复合体。建立兔骨缺损模型后,随机分为3组,每组各15只。实验组植入淫羊藿苷诱导形成的骨膜细胞三维支架复合体,聚己内酯组仅植入聚己内酯三维支架,对照组不植入任何材料。分别在植入后第2,4和8周取兔桡骨缺损处行苏木精-伊红染色观察骨愈合情况及成骨细胞的数量;于植入后4周拍摄各组兔桡骨X射线片。结果与结论:(1)与对照组相比,不同浓度的淫羊藿苷组在不同的时间点均显著促进骨膜细胞增殖(P<0.05),尤其是10^(-2) mol/L淫羊藿苷组(P<0.05),提示淫羊藿苷的最佳浓度为10-2 mol/L;(2)植入后4周,实验组骨细胞数量多,微小血管相对少;聚己内酯组可见较多的新生血管,少量编织样的新生骨和骨细胞;对照组见较多肉芽组织,骨细胞数量较少;植入后8周,对照组骨端可见纤维瘢痕组织,髓腔封闭,形成骨不连;聚己内酯组,骨缺损部分修复;实验组骨缺损部位完全被新生骨所替代,骨缺损修复。实验组成骨细胞数量显著多于其他2组(P<0.05);(3)植入后4周X射线情况:实验组骨缺损处基本愈合;聚己内酯组骨痂已经形成,骨断端部分相连;对照组骨缺损间隙仍清晰存在;(4)结果提示,不同浓度的淫羊藿苷均可促进骨膜细胞增殖,以10^(-2) mol/L最为显著。淫羊藿苷可诱导骨膜细胞在聚己内酯三维支架中形成细胞支架复合组织工程骨,可有效修复兔骨缺损。