参芪复方对糖尿病GK大鼠肝脏组织mRNA、lncRNA表达谱的影响

目的应用全转录组测序与实时聚合酶链锁反应(Real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术,探索参芪复方调控糖尿病GK大鼠肝脏信使RNA(messenger RNA,mRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达谱的机制研究。方法采用高脂高糖饲料建立2型糖尿病模型,将GK大鼠随机分为模型组、参芪复方组和西药组。另将10只Wistar大鼠设为空白组,予普通饲料喂养。参芪复方组大鼠予参芪复方浸膏灌胃,西药组予西格列汀混悬液灌胃,模型组及空白组灌服生理盐水。干预12周,每周检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)。运用HE染色法观察大鼠肝脏组织病理形态,在空白组、模型组和参芪复方组中每组随机选取4只大鼠进行全转录组测序,构建mRNA、lncRNA差异表达谱,分析差异基因生物学功能,并进行RT-qPCR验证。结果与空白组相比,糖尿病GK大鼠FBG显著升高(P<0.05),模型组大鼠肝脏可见肝细胞排列紊乱,边界模糊,出现弥漫空泡状改变,呈中度脂肪变性,伴见炎性浸润、弥漫水肿;与模型组相比,参芪复方组大鼠FBG在12周时明显降低(P<0.05),肝脏组织排列较整齐,脂质沉积、细胞水肿及炎细胞浸润明显减轻。全转录组结果显示,与空白组相比,模型组大鼠mRNA、lncRNA表达谱存在显著差异,决定了糖尿病大鼠生理病理上的差异表现。参芪复方可广泛调控mRNA、lncRNA的差异表达,富集分析显示参芪复方通过调控多条内分泌系统及代谢过程相关信号通路改善糖尿病,包括胰岛素分泌、非酒精性脂肪性肝病、胆固醇代谢、鞘脂代谢、胰岛素抵抗等信号通路。RT-qPCR结果显示,基因Irf1、Trim30、Tmcc3、Insig1与转录组结果一致,转录组准确性较高。结论参芪复方发挥调节血糖及改善肝脏脂质沉积、水肿的作用,可能与广泛调控mRNA、lncRNA的差异表达有关。

基于网络药理学和分子对接探究参芪复方治疗糖尿病肾病分子机制

目的运用网络药理学和分子对接技术探讨参芪复方治疗糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)的分子机制。方法首先运用TCMSP数据库获得参芪复方的活性成分及对应靶点;从OMIM、DrugBank、TTD、GeneCards数据库中筛选获得DKD的相关靶点。接着将参芪复方活性成分靶点和疾病靶点取交集,得到交集靶点。运用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-靶点”(D-A-T)网络图。然后将交集靶点上传至String平台进行PPI网络分析,并挖掘网络中核心靶点;采用Metascape平台分析对交集靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。最后,运用AutoDock Vina 1.1.2对参芪复方的核心成分与核心靶点进行分子对接验证。结果研究发现参芪复方通过槲皮素、山柰酚、木樨草素等核心成分作用于AKT1、IL6、MAPK1、VEGFA等核心靶点,调节糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、胰岛素抵抗、松弛素信号通路,并且参与了对有毒物质的反应、对受伤的反应、细胞迁移的正向调节等生物学过程以调控DKD。分子对接结果表明参芪复方中槲皮素、山柰酚、木樨草素等核心成分与AKT1、IL6、MAPK1、VEGFA等核心靶点均有良好的结合活性。结论研究通过网络药理学和分子对接技术揭示了参芪复方以多成分、多靶点、系统调节DKD,为进一步研究提供依据。

基于线粒体凋亡途径介导的骨骼肌细胞凋亡探究参芪复方对糖尿病骨骼肌病变的干预机制

目的 探讨参芪复方通过调控线粒体凋亡途径介导的骨骼肌细胞凋亡对糖尿病骨骼肌病变的作用。方法 以含5.56 mmol/L葡萄糖(Glucose, Glu)培养基及含25 mmol/L Glu的培养基分别培养L6细胞,模拟正常及糖尿病的生理环境。实验设置6组,为空白组、模型组、参芪复方低剂量组、参芪复方中剂量组、参芪复方高剂量组、罗格列酮组,分别给予含5.56 mmol/L Glu培养基稀释的10%空白血清、含25 mmol/L Glu培养基稀释的10%空白血清、5%参芪复方含药血清、10%参芪复方含药血清、15%参芪复方含药血清、300 ng/mL罗格列酮混悬液进行干预。药物干预24 h后收集细胞,以流式细胞术检测各组细胞凋亡率,以RT-qPCR和Western blot检测各组细胞内B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-xl基因(Bcl-xl)、Bcl-2同源拮抗剂/杀伤剂(Bak)、Bcl-xl/Bcl-2相关死亡启动因子(Bad)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt c)、第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂/低等电点IAP直接结合蛋白(Smac/Diablo)、细胞凋亡诱导因子(AIF)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的基因与蛋白表达水平。结果 与空白组相比,模型组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),细胞内Bak、Bax、Cyt c、Smac/Diablo、AIF、Caspase-3、Caspase-9的基因与蛋白表达显著增加(P<0.05),Bad蛋白表达显著增加(P<0.05),Bcl-2的基因与蛋白表达显著降低(P<0.05),Bcl-xl基因表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,参芪复方组Bak、Bax、Caspase-9、Caspase-3的基因与蛋白表达显著降低(P<0.05),Bad、Cyt c、Smac/Diablo的蛋白表达显著降低,Bcl-2、Bcl-xl的基因与蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论 参芪复方糖尿病骨骼肌病变的干预作用可能是通过调控线粒体凋亡途径,降低高糖环境下骨骼肌细胞凋亡率来实现的。

参芪复方对糖尿病葡萄糖激酶大鼠肠道菌群及代谢影响的实验研究

目的 探讨参芪复方对糖尿病葡萄糖激酶(glucokinase, GK)大鼠血糖的影响及其潜在的效应机制。方法 40只5月龄糖尿病GK大鼠适应性喂养1周后将两次随机血糖≥11.1 mmol/L的大鼠随机分为模型组、参芪复方组、西格列汀组,每组各8只,予以高脂饲料喂养;8只5月龄Wistar大鼠设为空白组,予以普通饲料喂养。分组完成后模型组及空白组予以生理盐水5 mL/(kg·d)灌胃,参芪复方组予以参芪复方浸膏1.44 g/(kg·d)灌胃,西格列汀组给予西格列汀片悬液16 mg/(kg·d)灌胃,连续干预8周。在整个实验过程中观察各组大鼠的一般状况,并于灌胃前、灌胃4周、灌胃8周检测各组大鼠的随机血糖,在干预结束后观察结肠组织病理切片,无菌采集肠道粪便进行肠道菌群宏基因组学技术测序。结果 与空白组比较,灌胃前、灌胃4、8周、模型组、参芪复方组、西格列汀组的随机血糖水平显著升高(P<0.05);灌胃4周,参芪复方组、西格列汀组较模型组随机血糖无统计学意义(P>0.05);灌胃8周,参芪复方组、西格列汀组较模型组随机血糖显著降低(P<0.05);结肠组织病理显示模型组大鼠腺体结构破坏,杯状细胞减少,肠绒毛坏死脱落,有大量的炎性细胞浸润,部分甚至可见溃疡;参芪复方组仅在黏膜固有层及隐窝可见炎性细胞浸润,伴有黏膜下水肿;西格列汀组大鼠肠黏膜上皮完整,腺体结构排列规则,仅有少量的炎性细胞浸润。结肠组织损伤指数(TDI)评分结果显示,与空白组比较,模型组TDI更高(P<0.05);而参芪复方组、西格列汀组较模型组TDI有所降低(P<0.05);宏基因组学测序显示糖尿病GK大鼠较空白Wistar大鼠的肠道菌群更为丰富,但主要优势菌群组成基本一致;与模型组比较,参芪复方能显著增加门水平B/F比值,增加Fusobacteria丰度(P<0.01)、科水平上Marinifilaceae丰度(P<0.05)及属水平上Bacteroides、Prevotella丰度;同时KEGG分析发现差异肠道菌群的基因功能主要与物质代谢中的碳水化合物代谢相关,参芪复方能通过影响脂质代谢通路、次级代谢产物的合成、异生物素的降解和代谢这三条通路功能基因的表达来发挥治疗T2DM的作用。结论 益气健脾活血的参芪复方具有改善糖代谢紊乱的作用,通过调节肠道菌群,抑制免疫炎症,恢复内环境稳态可能是其发挥抗糖尿病潜在途径。

参芪复方对糖尿病血糖波动模型大鼠胰腺组织生物钟相关基因与肠道菌群的影响

目的探讨参芪复方对糖尿病血糖波动模型大鼠血糖稳态的影响及可能作用机制。方法30只自发性2型糖尿病GK大鼠随机分为模型组、参芪复方组和西格列汀组,每组10只,均予高脂饲料喂养4周建立血糖波动模型;10只Wistar大鼠设为正常组,予普通饲料喂养4周。造模成功后参芪复方组给予参芪复方浸膏1.44g/(kg·d)灌胃,西格列汀组给予西格列汀片悬液16mg/(kg·d)灌胃,正常组、模型组给予生理盐水5ml/(kg·d)灌胃,均连续8周。大鼠尾静脉取血,测1日内8:00、10:00、14:00、16:00、18:005次血糖水平,计算一日血糖平均水平(MBG)、最大血糖波动幅度(LAGE)、平均血糖的标准差(SDBG);实时荧光定量PCR法检测胰腺组织生物钟相关基因Id 2、Usp 2、CRY1、DBP mRNA表达;运用16S rDNA基因测序分析各组大鼠肠道菌群属水平分布情况。结果与正常组比较,其余各组大鼠MBG、SDBG升高,模型组和参芪复方组LAGE亦升高(P<0.01);与模型组比较,参芪复方组和西格列汀组大鼠MBG、SDBG、LAGE均降低(P<0.01),西格列汀组在降低SDBG、LAGE方面优于参芪复方组(P<0.01)。与正常组比较,模型组大鼠Usp 2、CRY1 mRNA表达及丁酸菌属水平均降低(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,参芪复方组和西格列汀组大鼠Id 2 mRNA表达降低,Usp2、CRY1 mRNA表达升高,拟杆菌属、丁酸菌属水平亦升高(P<0.05或P<0.01);各组DBP mRNA表达、布劳特氏菌属和罗氏菌属水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论参芪复方可能通过调节血糖波动模型大鼠胰腺组织生物钟相关基因的表达及肠道菌群菌属的分布,从而调节血糖稳态。

参芪复方对2型糖尿病模型大鼠骨骼肌病变的影响

目的探讨参芪复方防治2型糖尿病(T2DM)骨骼肌病变的可能作用机制。方法自发性2型糖尿病GK大鼠联合高脂饲料喂养制备T2DM大鼠模型。造模成功后,30只GK大鼠随机分为模型组、参芪复方组、罗格列酮组,每组10只,另设10只Wistar大鼠作为正常对照组。参芪复方组给予参芪复方浸膏14.4g/(kg·d)灌胃,罗格列酮组给予罗格列酮混悬液0.67 mg/(kg·d)灌胃,模型组和正常对照组均给予等体积生理盐水灌胃,均每日1次。8周后观察大鼠骨骼肌线粒体病理学改变;检测各组大鼠骨骼肌线粒体的线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、视神经萎缩因子1(Opa1)、动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fisl)、线粒体分裂因子(Mff)蛋白及mRNA表达。结果与正常对照组比较,模型组Mfn1、Mfn2蛋白及mRNA表达减少,Drp1蛋白及mRNA表达增多(P<0.05);与模型组比较,参芪复方组Mfn1、Mfn2蛋白及mRNA表达增多,Drp1蛋白及mRNA表达减少(P<0.05)。参芪复方组与罗格列酮组Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1、Fisl、Mff蛋白及mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。病理学结果显示,模型组大鼠骨骼肌线粒体肿胀、嵴结构不清,或见絮状变性及空泡状改变;参芪复方组大鼠骨骼肌线粒体仅轻度肿胀,肌纤维排列整齐,无萎缩;罗格列酮组可见骨骼肌线粒体肿胀、变性或见空泡形成,嵴走向紊乱、模糊。结论参芪复方可以明显改善T2DM模型大鼠骨骼肌早期病变,其作用机制可能与影响线粒体动力学密切相关。