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Expression of Shiga Toxin B Subunit at Cell Surface in E. coli K-12
1
作者 苏国富 Himanshu N.Brahmbhatt Kenneth N.Timmis 《Science China Chemistry》 SCIE EI CAS 1993年第11期1352-1360,共9页
The three parts(Stx17B, Stx27B and StxB) of Shiga toxin B subunit have been fused into a cell surface exposed loop of the LamB protein at a BamH I site between residues 153 and 154. Western blotting revealed that the ... The three parts(Stx17B, Stx27B and StxB) of Shiga toxin B subunit have been fused into a cell surface exposed loop of the LamB protein at a BamH I site between residues 153 and 154. Western blotting revealed that the three parts of Shiga toxin B subunit could be expressed as the Lamb fusion proteins in E. coli. Indirect immunofluorescence and immunoelectron microscopy analyses showed fusion proteins LamB/Stx17B and LamB/Stx27B could be expressed at cell surface in E. coli, but fusion protein LamB/StxB could not be expressed at cell surface; it was aggregated in cytoplasm and was toxic to host. This expression system provided a new way to construct an oral live vaccine against Shigella dysenteriae 1. 展开更多
关键词 shiga toxin b subunit LAMb gene E. COLI K-12 cell SURFACE expression.
全文增补中
大肠杆菌志贺毒素stxB融合基因的构建及其高效表达 被引量:3
2
作者 刘军 冯书章 +5 位作者 齐翀 孙洋 祝令伟 郭学军 尹铁勇 庄永菊 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期28-30,共3页
利用 PCR方法 ,从肠出血性大肠杆菌 O15 7∶ H7的基因组 DNA中 ,分别扩增出 Stx1B和 Stx2 B亚基的结构基因片段 ,然后再通过 PCR将这 2个片段连接起来 ,并定向克隆到表达质粒 p ET2 8a的 Nco 和 Eco R 位点之间 ,构建了重组表达质粒 p ... 利用 PCR方法 ,从肠出血性大肠杆菌 O15 7∶ H7的基因组 DNA中 ,分别扩增出 Stx1B和 Stx2 B亚基的结构基因片段 ,然后再通过 PCR将这 2个片段连接起来 ,并定向克隆到表达质粒 p ET2 8a的 Nco 和 Eco R 位点之间 ,构建了重组表达质粒 p MB1。将重组质粒转化到宿主菌 BL2 1(DE3)中 ,对重组菌株 BL2 1(p MB1)用 IPTG进行诱导表达 ,并对最佳诱导时间进行了探索。 SDS- PAGE电泳检测结果表明 ,重组菌株表达出了 16 30 0的目的蛋白 Stx2 B- L-Stx1B;经薄层扫描分析表明 ,表达量约占菌体总蛋白的 6 8.4 % ,且目的蛋白为包涵体表达 ,表达量约占细菌沉淀的84 .6 %。研究还表明 ,未用 IPTG诱导的 BL2 1(p MB1)菌株也可有少量目的蛋白的基础表达。不同诱导时间的结果表明 ,在 3~ 7h的诱导时间内 。 展开更多
关键词 Mb 表达量 蛋白S 融合基因 志贺毒素 再通 薄层扫描 诱导时间 位点 IPTG
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痢疾志贺氏毒素B亚单位在大肠杆菌中的高效表达 被引量:4
3
作者 苏国富 李丰生 +2 位作者 黄培堂 芮贤良 黄翠芬 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1993年第1期36-42,共7页
本文从痢疾志贺氏Ⅰ型菌W30864的染色体克隆了编码志贺氏毒素(Stx)的基因,表达Stx的基因位于约4.5kb的EcoR1片段内。一系列的生物学试验表明:我们构建的杂种质粒(pMGC001)能产生Stx,产量为亲代株的16倍,克隆株不仅有细胞毒和肠毒作用,... 本文从痢疾志贺氏Ⅰ型菌W30864的染色体克隆了编码志贺氏毒素(Stx)的基因,表达Stx的基因位于约4.5kb的EcoR1片段内。一系列的生物学试验表明:我们构建的杂种质粒(pMGC001)能产生Stx,产量为亲代株的16倍,克隆株不仅有细胞毒和肠毒作用,而且还有神经毒性。我们又从质粒pMGC001将志贺氏毒素的B亚单位(Stx-B)的基因克隆至表达载体pJLA503,获得了Stx-B在大肠杆菌中的高效表达,Stx-B已被纯化,其特异的多克隆和单克隆抗体也被制备。Western blot表明它们能与Stx-B进行特异的抗原抗体反应。 展开更多
关键词 痢疾 志贺氏Ⅰ型菌 基因克隆
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利用噬菌体随机肽库筛选可结合志贺毒素B亚单位的短肽序列 被引量:2
4
作者 包士中 王慧 +2 位作者 荫俊 杨慧盈 史晶 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期749-752,共4页
以制备的重组志贺毒素B亚单位(StxB)为靶标,利用噬菌体展示亲和淘选技术,经4轮筛选,从随机十二肽库中筛选到与StxB结合的一批噬菌体克隆,对特异结合活性较高的27个噬菌体克隆的表面展示肽进行序列测定,其中A6序列出现16次,A9和A3序列分... 以制备的重组志贺毒素B亚单位(StxB)为靶标,利用噬菌体展示亲和淘选技术,经4轮筛选,从随机十二肽库中筛选到与StxB结合的一批噬菌体克隆,对特异结合活性较高的27个噬菌体克隆的表面展示肽进行序列测定,其中A6序列出现16次,A9和A3序列分别出现2次和3次。为评价筛选克隆中和毒素毒性的能力,将展示肽出现频率最高的A6噬菌体克隆,体外与志贺毒素孵育进行动物试验,动物存活率达33.3%,表明毒素的毒性得到部分抑制,A6短肽可能发展成为志贺毒素的拮抗剂。 展开更多
关键词 志贺毒素b亚单位 噬菌体展示技术 淘选 毒性中和试验
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抗志贺毒素ⅡB亚单位单克隆抗体识别表位的初步鉴定 被引量:1
5
作者 陈洪章 曾浩 +3 位作者 毛旭虎 罗萍 余抒 邹全明 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第19期1831-1833,共3页
目的初步确定抗志贺毒素ⅡB亚单位(Stx2B)单克隆抗体(McAb)1H9、1H10、3E5识别的抗原表位。方法运用DNAstar Protean软件,对Stx2B(1~72aa)全抗原进行表位预测;采用截短法分段构建重组质粒Stx2B50(23~72aa),Stx2B54(1~54aa)。用IPTG... 目的初步确定抗志贺毒素ⅡB亚单位(Stx2B)单克隆抗体(McAb)1H9、1H10、3E5识别的抗原表位。方法运用DNAstar Protean软件,对Stx2B(1~72aa)全抗原进行表位预测;采用截短法分段构建重组质粒Stx2B50(23~72aa),Stx2B54(1~54aa)。用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Westernblot分析。结果1H9、1H10能够识别Stx2B和Stx2B50;3E5能够识别Stx2B、Stx2B50和Stx2B54。结论McAb1H9、1H10识别的抗原表位位于55~72aa,McAb3E5识别的抗原表位位于23~54aa。 展开更多
关键词 志贺毒素Ⅱb亚基 抗原表位 鉴定
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志贺毒素B亚基具有自身组装功能 被引量:1
6
作者 韩照中 苏国富 黄翠芬 《生物技术通讯》 CAS 1999年第4期246-249,共4页
利用基因工程表达的志贺毒素B亚基纯化产物研究志贺毒素的分子组装机理。首先对StxB进行了分离纯化,并将蛋白质纯品溶解在磷酸缓冲液中。利用蛋白质交联的方法证实,在磷酸缓冲液体系中 StxB可以自发聚合为不同的分子结构形... 利用基因工程表达的志贺毒素B亚基纯化产物研究志贺毒素的分子组装机理。首先对StxB进行了分离纯化,并将蛋白质纯品溶解在磷酸缓冲液中。利用蛋白质交联的方法证实,在磷酸缓冲液体系中 StxB可以自发聚合为不同的分子结构形式(单体至五聚体),并可以与游离和细胞膜表面的受体结合,对志贺毒素全毒素的细胞毒性有竞争抑制作用。结果表明,在没有A亚基存在的情况下,单独的StxB也可以自发组装为多聚体,说明StxB具有自身组装的能力。 展开更多
关键词 志贺毒素 b亚基 分子组装
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Ⅱ型志贺样毒素B亚单位的重组表达及其受体结合活性 被引量:1
7
作者 包士中 史晶 +2 位作者 蔡昆 荫俊 王慧 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期23-27,共5页
目的:在大肠杆菌中重组表达Ⅱ型志贺样毒素B亚单位(Stx2B),并对其表达形式和受体结合活性进行分析。方法:PCR方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7中钓取Stx2B编码基因,利用基因克隆技术构建重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21,IPTG诱导目的蛋... 目的:在大肠杆菌中重组表达Ⅱ型志贺样毒素B亚单位(Stx2B),并对其表达形式和受体结合活性进行分析。方法:PCR方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7中钓取Stx2B编码基因,利用基因克隆技术构建重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21,IPTG诱导目的蛋白高效表达并对表达的包涵体进行变性和复性处理,离子交换层析纯化蛋白。通过SDS-PAGE变性和非变形蛋白电泳,分析重组Stx2B的表达形式,并利用Hela细胞结合模型,评价重组Stx2B与细胞受体的结合活性。结果:构建的重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21能高效表达Stx2B,经变性、复性及离子交换层析操作,获得高纯度的目的蛋白。SDS-PAGE变性和非变形蛋白电泳分析显示,重组Stx2B以二聚体形式存在,单体之间通过二硫键相连。细胞结合试验显示,重组Stx2B与Hela细胞具有特异结合活性。结论:成功构建表达Stx2B的基因工程菌,Stx2B的受体结合活性不依赖于五聚体形式。 展开更多
关键词 Ⅱ型志贺样毒素b亚单位 重组表达 受体结合活性
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StxB/HlyA(CT)融合蛋白的分泌表达和StxB在小鼠内的特异免疫反应
8
作者 苏国富 Himanshu N.Brabmbhatt Kenneth N.Timmis 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 1993年第5期411-418,共8页
本文将志贺氏毒素B亚单位(StxB)与大肠杆菌溶血素A的C末端(HlyA(CT))相融合,蛋白StxB/HlyA(CT)不仅能在大肠杆菌中分泌到胞外,而且也能从aroA突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌中分泌出去。当用高拷贝质粒pUC18作载体时,上述融合蛋白对宿主细胞... 本文将志贺氏毒素B亚单位(StxB)与大肠杆菌溶血素A的C末端(HlyA(CT))相融合,蛋白StxB/HlyA(CT)不仅能在大肠杆菌中分泌到胞外,而且也能从aroA突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌中分泌出去。当用高拷贝质粒pUC18作载体时,上述融合蛋白对宿主细胞有毒性,但以低拷贝质粒pBR322取代之后,该融合蛋白不再对宿主细胞产生任何不利影响。融合蛋白StxB/HlyA(CT)无论是在aerobactin启动子、或是在β-内酰胺酶启动子的控制下,均能在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中恒定地表达,并能输送至胞外。以表达StxB/HlyA(CT)的aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL3261免疫小鼠,引起了显著的B亚单位特异的粘膜和血清抗体反应。首次报道了融合至大肠杆菌溶血素A的C末端的外源多肽能从沙门氏菌中分泌至胞外,这种分泌多肽且能刺激抗原的特异性免疫反应。 展开更多
关键词 志贺氏毒素b 免疫反应 融合蛋白
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志贺毒素保护性抗原的基因克隆与序列分析
9
作者 邢洪光 荫俊 +2 位作者 王慧 侯晓军 宋伟 《生物技术通讯》 CAS 2003年第4期285-287,共3页
根据GenBank报道的志贺毒素A、B亚单位基因序列设计合成两对引物,以Ⅰ型痢疾志贺菌的基因组为模板经PCR扩增获得3条DNA序列,将其分别插入pMD18-T载体,测序证明所获得的3条序列为志贺毒素A、B亚单位基因及其串联片段,与GenBank中相应序... 根据GenBank报道的志贺毒素A、B亚单位基因序列设计合成两对引物,以Ⅰ型痢疾志贺菌的基因组为模板经PCR扩增获得3条DNA序列,将其分别插入pMD18-T载体,测序证明所获得的3条序列为志贺毒素A、B亚单位基因及其串联片段,与GenBank中相应序列比较,同源性分别为99.5%、100%和99.8%。通过计算机软件对所推测的氨基酸序列进行了蛋白质参数分析。志贺毒素保护性抗原基因的获得为志贺毒素的免疫学研究准备了必要的材料。 展开更多
关键词 志贺毒素 保护性抗原 基因克隆 序列分析 表达 A亚单位 b亚单位
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EHEC O157:H7志贺毒素Ⅱ型A、B亚单位的表达及功能鉴定 被引量:1
10
作者 焦永军 郭喜玲 +5 位作者 史智扬 曾晓燕 朱进 孙慧 万佳艺 汪华 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期20-23,共4页
目的克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shigatoxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能。方法从EHECO157:H7基因组中克隆编码StxⅡ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切... 目的克隆、表达肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7志贺毒素(Shigatoxin,Stx)Ⅱ型A、B亚单位,并鉴定其免疫学功能。方法从EHECO157:H7基因组中克隆编码StxⅡ型A、B亚单位的基因,经测序、酶切后,导人表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌Top10F′,经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)-A和GST-B融合蛋白。分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得高免血清,观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用。结果StxⅡ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化;A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击。结论StxⅡ型A、B亚单位蛋白可以作为EHECO157:H7疫苗的候选分子,同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用。 展开更多
关键词 肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 志贺毒素Ⅱ型A b亚单位 功能鉴定
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志贺毒素B亚单位及其模拟表位的制备和免疫保护效应
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作者 包士中 史晶 +5 位作者 蔡昆 侯晓军 高翔 刘昊 荫俊 王慧 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2008年第6期537-540,共4页
目的:对重组表达的StxB和预测的模拟表位肽进行免疫保护效应评价。方法:用分子生物学方法构建基因工程菌,IPTG诱导表达重组StxB,经复性后进行离子交换层析纯化。同时采用生物信息学手段对StxB的表位相关参数进行分析,预测StxB可能的抗... 目的:对重组表达的StxB和预测的模拟表位肽进行免疫保护效应评价。方法:用分子生物学方法构建基因工程菌,IPTG诱导表达重组StxB,经复性后进行离子交换层析纯化。同时采用生物信息学手段对StxB的表位相关参数进行分析,预测StxB可能的抗原表位。以纯化的StxB和合成的模拟表位肽免疫小鼠后攻毒,评价StxB及其模拟表位肽的免疫保护效应。结果:表达并制备了90%以上纯度重组StxB;发现p14和p17多肽易形成转角和无规卷曲的柔性区段,可及性、极性和亲水性较强,是可能的抗原表位。免疫保护试验显示,经重组StxB和合成多肽免疫的小鼠发病延迟,症状减轻,存活率显著提高。结论:重组StxB和预测的模拟表位肽具有良好的免疫保护效果,为亚单位疫苗及其作用机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 志贺毒素b亚单位 模拟表位 免疫保护效应
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霍乱毒素B亚单位与志贺毒素2B亚单位融合表达及抗原性检测
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作者 李振军 孙强正 +1 位作者 景怀琦 徐建国 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期378-382,共5页
目的克隆表达出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7志贺毒素2B亚单位(Stx2B)与霍乱毒素B亚单位(CTB)的融合蛋白(CTB-Stx2B),并检测其抗原性和与神经节苷脂(GM1)结合能力。方法设计引物扩增融合蛋白CTB—Stx2B的编码基因ctb-stx2b... 目的克隆表达出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7志贺毒素2B亚单位(Stx2B)与霍乱毒素B亚单位(CTB)的融合蛋白(CTB-Stx2B),并检测其抗原性和与神经节苷脂(GM1)结合能力。方法设计引物扩增融合蛋白CTB—Stx2B的编码基因ctb-stx2b,T-A克隆测序验证后克隆入原核表达质粒pET30a(+)C,构建表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达、纯化,获得目的蛋白CTB-Stx2B,SDS-PAGE和Western-blot检测其抗原性和形成五聚体的能力;GMI-ELISA法检测其与GM1结合能力。结果扩增出约750bp的目的片段,测序鉴定与设计序列一致;原核表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b转化E.coliBL21(DE3)后,经酶切和PCR扩增鉴定正确;IPTG诱导后SDS-PAGE初步测定CTB-Stx2B单体的相对分子质量(Mr)约为20×10^3;Western-blot检测CTB-Stx2B能与CTB单克隆抗体结合,纯化产物经复性后大多以五聚体形式存在;ELISA检测CTB-Stx2B具有结合GM1活性。结论成功克隆、表达了融合蛋白CTB-Stx2B;表达的蛋白具有良好的CTB抗原性和GM1结合能力。 展开更多
关键词 肠出血性大肠埃希菌O157:H7 志贺毒素2b亚单位 霍乱毒素b亚单位 抗原性
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