产志贺毒素大肠杆菌毒力基因检测

目的 分析河南省 2 0 0 0～ 2 0 0 2年分离的 3 51株与产志贺毒素大肠菌 (STEC)感染有关的菌株 ,了解不同来源标本各种毒素基因携带模式。方法 应用多重PCR技术 ,检测所有菌株志贺毒素 (stx1和stx2 )、hlyA、eaeA、rfbO111和rfbO15 7基因。结果 3 51株待检菌株分为枸橼酸杆菌、O157:H7大肠杆菌、rfbO 15 7基因阳性不携带志贺毒素基因的大肠杆菌和rfbO15 7基因阴性携带志贺毒素基因的大肠杆菌 4种不同类型。 4种类型菌株具有 6种rfbO15 7、stx2 、stx1基因模式。携带志贺毒素基因的菌株主要源自波尔山羊、普通本地羊和病人 ,其它家畜家禽中有不同程度感染STEC。结论 河南省存在STEC的感染 ,主要以O157:H7大肠杆菌为主 ,但也存在其它非O157的STEC。

志贺毒素B(ShT-B)在E.coli中的融合表达及特异性抗体制备

用KpnⅠ、Hind Ⅲ酶切克隆载体pGEM-ShTB3，然后亚克隆入带有二氢叶酸还原酶(DHFR)的融合表达栽体pQE40，构建重组质粒pQE40-ShTB,转化到E。coli M15中，经IPTG诱导，实现了ShTB-DHFR融合蛋白的高表达，表达量约占菌体总蛋白的21．9％，为包涵体形式，在变性条件下，包涵体蛋白经螯合镍离子的次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和柱一步纯化，得到了纯度为90．5％的重组ShT-B．以纯化的shTB-DHFR融合蛋白免疫昆明鼠，并结合腹腔注射S180细胞，成功制备了抗ShTB腹水多克隆抗体，效价达1：1×10^6间接ELISA和Westem印迹结果表明，抗ShT-B多抗与重组蛋白和天然ShT均有特异性结合,本试验结果为毒素检测方法的研究奠定了基础。

志贺毒素及其分子生物学研究进展

志贺毒素(ShT)是由Ⅰ型痢疾志贺菌产生的一种重要的致病毒力因子,具有细胞毒、肠毒和神经毒三种毒性作用。近年来,ShT已被列入生物武器核查清单剂中禁控毒素之一,成为潜在的生物毒素战剂和生物恐怖病原。本文主要概述了ShT的生物学特性、分子结构与作用机制、检测与预防,以及分子生物学的研究进展。

痢疾志贺氏毒素B亚单位在大肠杆菌中的高效表达

本文从痢疾志贺氏Ⅰ型菌W30864的染色体克隆了编码志贺氏毒素(Stx)的基因,表达Stx的基因位于约4.5kb的EcoR1片段内。一系列的生物学试验表明:我们构建的杂种质粒(pMGC001)能产生Stx,产量为亲代株的16倍,克隆株不仅有细胞毒和肠毒作用,而且还有神经毒性。我们又从质粒pMGC001将志贺氏毒素的B亚单位(Stx-B)的基因克隆至表达载体pJLA503,获得了Stx-B在大肠杆菌中的高效表达,Stx-B已被纯化,其特异的多克隆和单克隆抗体也被制备。Western blot表明它们能与Stx-B进行特异的抗原抗体反应。

痢疾志贺氏Ⅰ型菌毒素基因的克隆与表达

从痢疾志贺氏Ⅰ型菌 W30864株中提取染色体 DNA,用 EcoRI 完全酶解,电泳回收3—7kb 的片段,与载体 pUC19质粒连接重组,用大肠杆菌痢疾样毒素(SLT)基因探针进行筛选,得到了阳性重组子。实验表明志贺氏毒素基因是位于约4.5kb 的 EcoRl 片段上,包含毒素的 A 亚单位基因和 B 亚单位基因。在对克隆株的毒性测定中,采用 Hela-S3细胞试验,证明所产生的痢疾毒素具有杀死细胞的能力。此毒素可引起肠积水和充血,可使小鼠肢体麻痹并致死,克隆重组株的痢疾毒素产量是亲本野生株 W30864的16倍。此外,实验中还对克隆株和产生 SLT 的菌株的毒素产量做了比较。

志贺毒素A/B(ShT-A/B)亚单位基因的克隆与序列分析

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺茵(Shigella dysenteriae type Ⅰ)中,分别扩增出约895bp和225bp的成熟ShT-A,B基因片段,直接克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-ShTA_2和pGEM-ShTB_3。测序结果表明,插入的片段是ShT-A,ShT-B,且与GenBank中ShT-A,B核酸序列完全一致,从而为重组ShT-A,B的表达研究奠定了基础。

宋内Ⅰ相O抗原及霍乱毒素B亚基在福氏2a痢疾菌中的表达及其免疫保护效果的观察

本文利用基因重组的方法，将宋内Ｉ相Ｏ抗原基因以及霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ｃｔｘ－Ｂ）克隆至带链球菌的ａｓｄ基因的表达载体，然后转化至ａｓｄ－痢疾菌苗株福氏２ａＴ３２。脂多糖银染以及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验证实以上两基因都能在宿主菌中稳定表达。动物（小白鼠）保护实验表明，该重组菌对福氏２ａ、宋内氏痢疾菌的保护效率达１００％，对霍乱弧菌的保护效率也达７０％。该菌具有稳定、无抗生素标记、多价的特点。

几种肠道菌中细胞致死性肿胀毒素的检测及其细胞毒性初步研究

目的了解肠出血性大肠杆菌、非典型致泻性大肠杆菌、志贺菌及部分肠杆菌中CDT毒素基因存在情况及其细胞毒性。方法用PCR方法检测cdt基因,并将阳性菌株培养上清与HeLa细胞共同孵育检测细胞形态的改变,初步评价CDT毒素的表达及其细胞毒性。结果在肠出血性大肠杆菌O157∶NM中,cdt基因检出率为16.28%(7/43),其中3株为cdt-III型,其他4株为cdt-I型;携带HPI毒力岛的非典型致泻性大肠杆菌中cdt基因检出率为6.25%(5/80);在志贺菌中,cdt基因检出率为2.67%(4/150),非典型致泻性大肠杆菌和志贺菌检出的cdt基因全部为cdt-I型。而在O157∶H7大肠杆菌、枸橼酸杆菌和沙门菌未检出cdt基因。所有cdt基因阳性菌株均使HeLa细胞出现典型的细胞肿胀变化,效应滴度介于1∶2到1∶16之间。结论CDT毒素只在肠出血性大肠杆菌O157∶NM、携带HPI毒力岛的非典型致泻性大肠杆菌和志贺菌中检出,且检出率均比国外同类菌株低,其存在是否与疾病严重程度相关及其细胞毒性机制尚须进一步研究予以证明。

志贺毒素研究进展

志贺毒素(Shiga toxin,Stx)是志贺菌和某些大肠埃希菌等产生的一种重要的毒力因子,包括志贺毒素1(Stx1)和志贺毒素2(Stx2)两种型别。该毒素由λ样志贺毒素噬菌体编码,通过切割核糖体28S rRNA 3′端腺苷酸从而抑制蛋白质合成,也可通过多种途径诱导细胞凋亡。人感染产志贺毒素的细菌可出现腹泻或出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),严重者可导致溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS),甚至死亡。目前,尚无特异性治疗志贺毒素所致疾病的方法,但近年来志贺毒素在癌症靶向治疗或成像等医学领域的应用前景已引起人们的兴趣。本文就志贺毒素的命名、分型、分子结构、遗传学基础、作用机制、应用前景等方面的研究进展做一简要综述。

宋内痢疾菌无毒株S7表达霍乱弧菌O抗原及霍乱毒素B亚单位工程菌的构建

以宋内氏痢疾菌无毒株S7作为受体,将含有编码霍乱弧菌O抗原及霍乱毒素B亚单位基因的质粒转移入其中,构建成重组菌株S7COB。质粒电泳图谱显示重组株中存在被转移的外源质粒。重组株的生化特性和毒力表型与受体相同。菌体凝集和全菌体酶联免疫吸附试验(ELISA)证明在重组株的菌体表面同时表达了霍乱弧菌和宋内氏痢疾菌的O抗原。GM1-ELISA表明该重组株能在细胞内表达霍乱毒素B亚单位。以5亿、10亿的重组株免疫LIBP品系小鼠,免疫小鼠对宋内氏毒株S63攻击的保护率为70％～100％,对霍乱弧菌毒株569B攻击的保护率为30％～54％。