人Shisa样蛋白1(SHISAL1)抗原表位区预测及其小鼠多克隆抗体的制备

目的优化人Shisa样蛋白1(SHISAL1)抗原后制备小鼠抗多克隆抗体,并鉴定抗体特异性.方法利用生物信息学方法预测SHISAL1蛋白的抗原表位区,选取SHISAL1蛋白第28~97位氨基酸残基组成的多肽作为抗原,并命名为(SHISAL1-N);利用分子克隆技术,将其编码序列克隆后插入pET-28a载体中构建重组质粒pET28a-SHISAL1-N.然后将pET28a-SHISAL1-N和已构建的pET28a-SHISAL1全长重组质粒转化BL21(DE3),用异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.两种蛋白纯化后分别免疫雌性昆明小鼠,Western blot法、免疫沉淀及免疫荧光细胞化学染色法观察两种抗体的特异性与灵敏性.结果成功构建pET28a-SHISAL1-N重组质粒,诱导两种融合蛋白表达,获得两种类型的SHISAL1小鼠多克隆抗体.Western blot结果表明以SHISAL1为免疫原所制备的抗体特异性和灵敏性较差,而以SHISAL1-N免疫原所制备的抗体能特异性识别不同的细胞内源性的SHISAL1蛋白;免疫沉淀结果表明SHISAL1-N抗体可以结合肝癌细胞中的SHIISAL1蛋白;免疫荧光细胞化学染色结果证明SHISAL1-N抗体与细胞质中的SHISAL1蛋白特异性结合.结论成功优化SHISAL1抗原并制备了小鼠抗人SHISAL1多克隆抗体,可应用于Western blot实验、免疫沉淀和免疫荧光细胞化学染色.