超灵敏高特异性巢式PCR检测方法的建立及其在大黄鱼(Larimichthys crocea)弧菌病早期预警中的应用

由哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)及溶藻弧菌(V.alginolyticus)等病菌感染导致的弧菌病是大黄鱼养殖中最常见、最具危害性的疾病之一,然而目前针对发病后的遏制手段有限,因此亟待建立高灵敏度、高特异性的病原检测技术以实现病害早期预警。在普通两轮巢式PCR引物的基础上,对这3种弧菌分别设计一套三轮巢式PCR引物,通过扩增条件优化、特异性检验及灵敏度测定,确定了能精准检测3种弧菌的方法,达到了扩增产物单一、参考菌假阳性检出率为0、靶序列最低检出灵敏度分别为2.50 copies/μL(哈维氏弧菌)、3.12 copies/μL(副溶血弧菌)、2.53 copies/μL(溶藻弧菌)等效果。利用开发的检测方法,检测了2021~2023年度浙江、福建一带大黄鱼养殖样本,所有样本均检测出哈维氏弧菌和溶藻弧菌,副溶血弧菌未检出。结果显示浙江、福建一带大黄鱼弧菌病主要是由哈维氏弧菌和溶藻弧菌引起。开发的检测方法有望应用于大黄鱼等养殖物种弧菌病的早期预警和常规检测。

不同增重性能大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼间体尺性状对体质量影响效果的差异

分析影响大黄鱼幼鱼同生群内速生子群和普通子群体质量的体尺形态性状组合差异,进而解构导致两者间增重机制差异的内在逻辑,对于指导大黄鱼幼鱼速生种质发掘与选育具重要价值。于象山西沪港海域,随机取样经板式网箱养殖3个月的3000尾大黄鱼同生群幼鱼并全数称量后,按体质量大小筛得速生子群[体质量取值居于前5%,范围(3.01~4.81 g),记为FG]和普通子群[体质量取值居中,出现率50%,范围(1.61~2.33)g,记为CG]。随机取FG和CG子群各30尾,逐尾测得体质量(BW)、体长(X_(1))、肛长(X_(2))、侧线长(X_(3))、尾柄高(X_(4))、腹鳍间距(X_(5))、头长(X6)和头宽(X7)后,采用多元分析方法定量研究了体尺性状对FG和CG子群体质量影响效果的差异。结果表明:(1)所涉各项生物学性状的测定值均呈FG>CG(P<0.05),且两者变异系数最大的性状均为X_(4),分别达30.07%和26.70%;(2)经主成分分析,提取到2个特征根值大于1的主成分,其中PC1主要影响变量为X_(1)、X_(2)和X_(3),PC_(2)主要影响变量仅为X_(4),两者的方差累计贡献率为83.285%;经判别分析筛留的X_(1),对两者的综合判别准确率为91.67%;(3)经通径分析,FG、CG子群被保留的体尺性状组合对BW的直接作用排序分别为X_(5)>X_(2)>X_(3)和X_(1)>X6>X_(4)>X7,间接作用分别为X_(2)>X_(3)>X_(5)和X7>X6>X_(1)>X_(4),它们的决定系数加和值和复相关指数均相同,分别为0.848和0.888;(4)经偏回归分析,获得了用以估算FG、CG子群BW的多元线性回归方程组。研究结果可为大黄鱼速生种质甄别与发掘提供参考。

基于转录组研究饥饿对大黄鱼(Larimichthys crocea)生长和代谢的影响

大黄鱼(Larimichthys crocea)作为我国产量最高、养殖规模最大的海水养殖鱼类,长时间不合理的饥饿易导致养殖效率低下,因此,需要合理控制越冬禁食时间。为了探究饥饿对大黄鱼的影响,在水温9.0~14.3℃条件下进行了饥饿0、8、16周的越冬养殖实验,研究了低温与饥饿双重胁迫下的大黄鱼生长、体成分、抗氧化酶活力以及相关基因的表达。结果显示,随着饥饿时间的延长,大黄鱼的肝体比(HSI)、脏体比(VSI)、肌肉和全鱼的粗脂肪和粗蛋白以及肝糖原含量显著降低(P<0.05),肌糖原含量无显著变化(P>0.05)。肝脏抗氧化酶丙二醛(MDA)活性先升高后降低;谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性显著降低(P<0.05),甘油三酯(TG)含量显著上升(P<0.05)。转录组分析结果显示,相比对照组,饥饿后差异基因显著下调,GO分析发现,饥饿后差异基因主要富集在脂质代谢过程、脂肪酸生物合成和补体激活等方面。聚类分析表明,饥饿16周后,脂肪代谢通路中肉碱棕榈酰转移酶1 (CPT1)、线粒体三功能酶β亚基(HADHB)、肉碱棕榈酰转移酶2 (CPT2)基因的相对表达水平升高,而脂肪酸延长酶(HACD)、脂肪酸合成酶(FASN)、5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)基因的相对表达水平下降;免疫代谢通路中丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERP)、纤维蛋白原-1 (FGG-1)、纤维蛋白原-3 (FGG-3)、纤维蛋白原β (FGB)基因的相对表达水平也降低,qRT-PCR也证实了以上结果。综上所述,越冬期间,长时间的饥饿将抑制大黄鱼的生长和免疫相关基因的表达,促进其肝脏抗氧化能力和脂质代谢相关基因的表达。

小黄鱼(Larimichthys polyactis)消化道形态与组织学结构特征及其消化酶活性的研究

为了解小黄鱼(Larimichthys polyactis)消化道结构特点及其功能与食性的相关性,采用解剖、石蜡切片、AB-PAS反应及酶活检测技术,观察研究了小黄鱼消化道的形态及组织学结构、黏液细胞定位及消化酶活性。结果显示:消化道由口咽腔(舌)、食道、胃及肠构成,食道粗短,胃卜型,肠呈“S”型弯曲,肠指数为0.63;舌上皮中分布有味蕾及少量各型黏液细胞。食道、胃及肠均由黏膜层、黏膜下层、肌层及外膜组成;食道含初级及次级突起,分别被覆复层扁平及单层柱状上皮,大量黏液细胞分布于复层上皮内,以Ⅱ型为主。胃内胃腺发达,分布有大量Ⅰ及Ⅱ型黏液细胞;胃中蛋白酶活性较高。肠上皮为单层柱状上皮,上皮层分布有各型黏液细胞,以Ⅱ型为主;肠道肌层厚度、黏膜褶皱高度及黏液细胞总密度由前往后递增;肠道中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及碱性磷酸酶活性较高,且后肠高于前、中肠。小黄鱼消化道形态、组织结构及酶活性分布特点与其肉食食性相适应,口咽腔(舌)及食道上皮具有较好的保护作用,胃在蛋白质消化吸收方面发挥重要作用,肠道在蛋白质、脂类、糖类、无机盐等物质的消化吸收方面起重要作用。

黄海南部和东海小黄鱼(Larimichthys polyactis)产卵场分布及其环境特征

根据2003～2005年和2007年4月份在黄海南部和东海海域进行的底拖网调查数据，分析了小黄鱼产卵场分布和产卵场环境特征等。结果表明，目前小黄鱼产卵场范围较过去有扩大，范围已经扩展到外海海域，产卵场可分为黄海南部产卵场和东海产卵场；其中黄海南部产卵场主要集中在33°00′～34°00′N，122°30′～124°00′E，产卵场最适水温范围为9．65～12．17℃，最适盐度范围为32．25～34．54，最适水深范围为29．74～76．49m；东海产卵场主要集中在30°30′～31°00′N，124°00′～125°00′E海域和30°30′～32°30′N，125°00′～126°00′E海域，产卵场最适水温范围为10．13～16．64℃，最适盐度范围为32．50～34．37，最适水深范围为40．23～85．61m；黄海南部和东海产卵场水温分布差异极显著（P〈0．01）；小黄鱼产卵场较过去发生较大变化的主要原因可能是在过度捕捞等扰动因素的影响下，小黄鱼对环境适应性明显提高。

大黄鱼(Larimichthys crocea)耐环境因子试验及其遗传力的估计

通过大黄鱼15个半同胞家系鱼苗对低盐、低溶氧和低pH值水体的抗性试验,采用半同胞组内相关法,对大黄鱼耐各环境因子遗传力进行了估计。结果表明,大黄鱼40日龄鱼苗在水体溶氧4.76—1.21mg/L时2.5—10h以内全部死亡,盐度8.05—9.03时1—30h内全部死亡,pH值4.49—5.2时1—8h内全部死亡;对耐低溶氧、低盐和低pH值的遗传力估计值分别为0.23、0.10和0.23,t检验表明对耐低溶氧和低pH值的遗传力估计达到显著水平,耐低盐遗传力的估计不显著。

大黄鱼(Larimichthys crocea)补体调节因子CFH和CFHR2基因的分子特征及表达分析

补体是鱼类免疫系统重要的组分,具有识别和消除外来病原体,激活免疫细胞,调控获得性免疫等功能。在免疫组织中,补体调节因子大约占据了补体成分的二分之一,当受到外界病原刺激时会迅速活化补体成分,并且进一步聚合形成酶复合物发挥一系列免疫效应。CFH和CFHR2是补体替代途径重要的调节因子,对于补体系统正常运转必不可少。为此,本文测定了大黄鱼补体调节因子CFH和CFHR2基因的c DNA全序列,并对基因组织特异性表达和溶藻弧菌刺激后基因m RNA表达量的变化等方面进行了研究。CFH和CFHR2序列全长分别为1332 bp和1170 bp,分别编码443和389个氨基酸,N端信号肽序列分别为24和32个氨基酸。推导的氨基酸序列结构分析表明大黄鱼CFH和CFHR2基因具有RCA蛋白家族的典型特征,即含有多个保守的CCP结构(补体控制蛋白)。实时荧光定量PCR结果显示,CFH和CFHR2在健康大黄鱼的肝、脾、肾、肠、脑、胃、心和肌肉这8种组织中都有表达,其中肝脏的表达量显著高于其它几种组织。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染了健康的大黄鱼之后,CFH和CFHR2的m RNA表达量均明显上调,并且随着感染时间的变化呈现不同的上升趋势。结果表明补体调节因子m RNA表达量的变化与溶藻弧菌的侵染密切相关,表明了CFH和CFHR2可能在大黄鱼自身免疫机制中发挥重要的作用。

高温对大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼血清生化指标的影响

研究了持续7 d和14 d 32℃高温对12月龄大黄鱼血清生化指标影响,结果表明:高温处理7 d后,碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶同工酶、谷酰转肽酶、乳酸脱氢酶的活性均有所升高,除碱性磷酸酶,其余五种酶与对照组(25℃)差异均达到极显著水平(P<0.01);血清中Cl-、Na+和Ca2+的浓度与对照组差异不显著(P>0.05),而K+的浓度显著低于对照组(P<0.05);血清中总蛋白、胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、尿素氮的含量均有所降低,其中尿素氮、胆固醇、甘油三酯、葡萄糖的含量与对照组差异达到显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。高温处理14 d后,除肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶的活性显著高于对照组外(P<0.01),其它酶与对照相比差异不显著(P>0.05);血清中Ca2+、K+的浓度显著低于对照组(P<0.05),Cl-、Na+的浓度与对照组差异不显著(P>0.05);尿素氮、胆固醇的含量与对照组差异达到显著水平(P<0.05)。以上研究表明:高温处理7 d、14 d,肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶、K+浓度、尿素氮和胆固醇5个指标与对照相比都存在显著的变化,可作为大黄鱼对高温的反应指标。

小黄鱼(Larimichthys polyactis)胚胎发育及仔、稚鱼形态特征观察

采用干法授精方法获得受精卵,在人工培育条件下对小黄鱼的胚胎及仔稚鱼形态发育进行观察,描述了各发育时期的发育时序和形态特征。结果表明,小黄鱼受精卵呈圆球形,无色透明,单油球,浮性,卵径(1413±73)μm,油球径(465±23)μm。在水温(18±0.5)?C,盐度28下,历时50h40min完成孵化。初孵仔鱼全长(3256±112)μm,卵黄囊长径(1260±50)μm,短径(894±65)μm,肌节32对。在水温(19±1)?C下,仔、稚鱼发育历时35天,4日龄仔鱼开口摄食,6日龄卵黄囊消失,10日龄油球消失,15日龄尾椎骨向上弯曲,25日龄全长(7467±550)μm,各鳍发育基本完成,进入稚鱼期,35日龄全长(22158±420)μm,全身被鳞,进入幼鱼期。

fSSR分析技术的建立及在大黄鱼(Larimichthys crocea)亲子鉴定中的应用

以大黄鱼(Larimichthys crocea)为材料,对荧光标记微卫星(fSSR)分析体系进行了优化,建立了适合大黄鱼fSSR分析的最佳条件。与常规的银染法相比,该方法成本略高,但其分辨率高,可重复性强,检测效率为银染法的6～10倍。利用优化的fSSR技术进行了大黄鱼亲子鉴定的研究,结果显示在使用6对引物的情况下,大黄鱼两个群的亲子鉴定率超过99%。

小黄鱼(Larimichthys polyactis)线粒体基因组结构与特征

采用长片段扩增策略,获得鲈形目石首鱼科黄鱼属小黄鱼的线粒体基因组全序列。组装分析结果表明,其长度为16470bp,H链碱基组成呈明显反G偏倚,G含量仅为16%。13个蛋白质基因起始密码子均为ATG。COI基因的终止密码子为AGA,ND1和ND3基因为TAG,COII、ND4和Cytb基因为不完全终止密码子T,其余7个基因都是完整的TAA。在小黄鱼mtDNA中发现2个特殊发夹结构,一个是轻链复制起始区(OL)的发夹环,位于tRNA簇,环区T含量仅为9%,而G含量达45%,这与哺乳动物和爪蟾该区域富含T有所不同。另一个假定发夹结构位于ATP6基因末端,这种二级结构可能与准确转录有关。该mtDNA控制区长度为799bp,5′端含有9个连续TA串联重复和2个5′-ATGTA---TACAT-3′重复,与已报道的鱼类扩展终止相关序列模式恰恰相反;中央控制区仅识别出CSB-E结构;保守序列区含有CSB-1,2,3,其中CSB-2具有高度保守性。对小黄鱼和大黄鱼的mtDNA比较进化研究,根据分子钟假说,估计二者线粒体基因组的进化分歧时间为4.8百万年前。

大黄鱼(Larimichthys crocea)IGF-Ⅰ基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了大黄鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA的全序列,序列全长2027bp,由57bp的5’非翻译区、1409bp的3’非翻译区和561bp的开放阅读框组成。序列分析表明,大黄鱼IGF-Ⅰ编码区包括信号肽、成熟肽(B、C、A、D)和E等6个区域的186个氨基酸,形成成熟肽时,信号肽和E区被切除,成熟肽分子量7.5kDa,等电点(pI)为7.76,成熟肽的B区和A区有6个保守的半胱氨酸残基,形成3对二硫键,起到了稳定IGF-Ⅰ三维结构的作用。与其它物种的IGF-Ⅰ比对后发现A、B区域比较保守,C、D区域保守性较差;E区域的分析结果表明,大黄鱼IGF-ⅠcDNA序列为Ea-4亚型。核苷酸同源性分析发现,大黄鱼IGF-ⅠcDNA与美国红鱼同源性最高,为99.47%;与斜带石斑鱼、金头鲷和褐牙鲆的同源性依次降低,分别为97.68%、97.50%和95.90%。

野生和养殖大黄鱼(Larimichthys crocea)品质特征与差异性探究

为探究养殖与野生大黄鱼品质的差异性,与现有主要养殖模式(深水网箱S1、围网S2、多通框网箱S3、池塘S4和筏式小网箱S5)中大黄鱼的外观、质构、基本营养、脂肪酸、氨基酸、风味物质和矿物元素等进行比较。结果表明,养殖和野生大黄鱼鳞片紧致、完整,体表光泽,粘液透明,眼球饱满;野生鱼的内聚性、弹性、咀嚼性、剪切力显著高于养殖鱼(p<0.05),养殖鱼间内聚性、剪切力差异不显著(p>0.05);野生鱼的粗脂肪含量为9.76%,显著小于养殖鱼(10.74%~14.00%)(p<0.05),且其粗蛋白含量为21.02%,显著高于养殖鱼(17.05%~17.35%)(p<0.05);野生和养殖大黄鱼的脂肪酸组成中Σ饱和脂肪酸(SFA)>Σ单不饱和脂肪酸(MUFA)>Σ多不饱和脂肪酸(PUFA),而野生鱼的Σ(二十碳五烯酸+二十二碳六烯酸)(EPA+DHA)为12.84%、ΣPUFA(n-6)为2.15%和ΣPUFA(n-3)为14.22%,均低于养殖鱼;野生鱼的总氨基酸(TAA)含量为14.64%、非必需氨基酸(NEAA)含量为7.40%、半必需氨基酸(SEAA)含量为1.31%和必需氨基酸(EAA)含量为5.93%,均显著高于养殖鱼(p<0.05);野生和养殖鱼的次黄嘌呤核苷酸(IMP)含量分别为0.80μmol/g和0.98~1.03μmol/g,在所有呈味核苷酸中最高。野生鱼和养殖鱼常量元素含量Ca>K>Na>Mg,微量元素Cu含量最小。野生和养殖鱼Zn:Cu,野生、S1和S2的Zn:Fe,均在合理范围内。本研究可为提升养殖大黄鱼品质和优化养殖模式等提供依据。

基于CNKI数据库的大黄鱼(Larimichthys crocea)种质资源及其开发利用研究进展

种质资源是大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖生产和遗传改良必不可少的物质基础,及时掌握大黄鱼种质资源研究、开发及利用现状的研究热点和研究方向,对大黄鱼产业发展具有重要意义。以大黄鱼产业发展现状为基础,以中国知网(CNKI)数据总库作为文献来源,采用文献计量分析的研究方法,围绕大黄鱼种质资源、人工繁育、养殖及育种主题,建立检索式。截至2021年12月31日,经过人工方法筛选,共得到555篇期刊文献为研究对象。从研究论文发表数量、期刊分布情况和研究机构分布情况进行分析,并利用NoteExpress软件对主题关键词绘制了词频云图,进行词频分析。结果显示,大黄鱼种质资源研究、开发及利用方面的热点主要在3个方面,即大黄鱼分类地位、地理分布及其种群划分的研究;大黄鱼种质资源鉴定评价研究;大黄鱼种质创新方面的研究。最后,从种质资源保护和鉴定评价、重要经济性状遗传解析、基因组资源发掘、新品种培育和良种示范推广等方面对未来大黄鱼种质资源的开发利用研究提出了建议。

大黄鱼(Larimichthys crocea)浙江岱衢族养殖群体与福建闽-粤东族群体遗传多样性分析

为了解浙江（宁波）养殖岱衢族大黄鱼与福建闽粤东族大黄鱼群体的遗传差异,利用5对AFLP引物和14对微卫星（SSR）标记对宁波2个岱衢族大黄鱼养殖群体与福建官井洋野生和养殖群体进行了比较研究.研究发现：AFLP选择性扩增引物在4个群体中共扩增出244个清晰的条带,岱衢族养殖群体（NBB）的多态位点比例最低,为54.51%,其余3个群体则均在63%左右.微卫星引物分析出4群体平均等位基因数在6.00-8.36之间,观测杂合度为0.68-0.78,期望杂合度只有岱衢洋野捕群体的F1代（NBA）群体为0.75,其余群体均大于0.80.基于AFLP和SSR数据计算群体间遗传相似系数和遗传距离进行聚类分析,结果均显示,官井洋野生群体（GJY）与养殖群体（FJ）在遗传上最为相似,聚类为一支,宁波养殖的2个群体（NBA,NBB）聚类为另外一支.综合4群体的各方面遗传差异参数可知,福建2个群体的遗传多样性比宁波2个养殖群体的略高.观察其三维散点聚类图和最小进化树均可发现,NBA群体的遗传结构与其他3个群体明显不同,并发现福建野生群体中有2个个体应属于福建养殖群体后代.

小黄鱼(Larimichthys polyactis)鰤鱼诺卡氏菌的分离及鉴定

为探明舟山海域网箱养殖小黄鱼(Larimichthys polyactis)暴发的以体表溃疡、眼球溃烂、内脏出现白色结节为主要症状的疾病病因,对患病小黄鱼体表溃疡处和结节病灶处采集组织样本,在血琼脂平板上划线培养,通过分离、纯化到同一优势菌株ZHNK2101。经形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因片段扩增及序列比对,确定该菌株为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。药敏试验结果显示,菌株ZHNK2101对哌拉西林、头孢曲松、丁胺卡那、庆大霉素等16种抗生素敏感。回归感染试验表明,该菌株可以感染小黄鱼并引起和自然感染相同的症状,半致死浓度LD50为7.28×10^(4)CFU/尾。另外,该病株会引起小黄鱼鳃、肝、肾和脾脏发生病理变化,主要表现为鳃丝紊乱,肝脏、肾脏、脾脏组织细胞纤维化形成病理性结节。试验首次报道了小黄鱼感染鰤鱼诺卡氏菌的病例,并从理化特性、药敏试验、回归感染及组织病理变化等方面对该菌株的特性进行了初步研究,为小黄鱼养殖过程中由鰤鱼诺卡氏菌引起的内脏白点病的早期预防和治疗提供基础数据。

小黄鱼(Larimichthys polyactis)精子的生理特性及超低温冷冻保存研究

为了解养殖小黄鱼精子的生理特性及超低温冷冻保存效果,用计算机辅助精子分析系统(CASA)检测了小黄鱼精子的运动参数及盐度、pH、葡萄糖、离子等环境因子的变化对其精子活力的影响;探究了稀释液、抗冻剂、稀释比及降温高度等对精子冷冻保存效果的影响。结果显示:小黄鱼精液的精子密度为(6.92±1.20)×10^9/mL。精子经自然海水激活后,运动率、运动时间及寿命分别为(59.31±4.85)%、8.44±0.87min及12.20±0.50min,直线运动速率(VSL)、曲线运动速率(VCL)及平均路径运动速率(VAP)分别为11.96±5.21、25.38±7.19和22.33±6.88μm/s。精子运动适宜的盐度范围为25-30、适宜的pH范围为7.5-8.5,精子在盐度25或pH 8.0的海水中活力较好。精子激活效果较好的葡萄糖浓度为0.7-0.9mol/L;浓度0.9mol/L时,精子活力较好。精子激活效果较好的KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液浓度分别为0.4-0.5、0.4-0.6、0.7-1.0和0.2-0.3mol/L;精子在KCl及CaCl2溶液中活力相对较差,运动率等参数显著低于对照组;精子在不同人工海水中的运动率显著低于自然海水中的运动率,但精子在单一离子缺陷型人工海水及全人工海水中的运动率无显著差异。以0.25mL麦细管为冻存管,6种稀释液、不同浓度的4种抗冻剂、5种稀释比及5种降温高度对小黄鱼精子冷冻保存效果的影响试验发现,以HBSS液1︰3稀释精液,添加10%DMSO及15%PG为抗冻剂,液氮面上3.5cm处降温5min后投入液氮中保存效果较好,冻精解冻后运动率达(43.57±2.59)%及(43.06±6.77)%。

大黄鱼(Larimichthys crocea)Ⅰ型干扰素基因的特征与表达分析

采用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)Ⅰ型干扰素基因全长cDNA序列及其基因组序列,并利用荧光定量PCR技术研究了该基因在大黄鱼不同组织中的表达谱,以及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、LPS、polyI:C刺激后大黄鱼脾脏、肝脏和头肾组织中该基因在转录水平的表达变化。结果表明,大黄鱼Ⅰ型IFN基因全长cDNA为878bp,开放阅读框558bp,编码185个氨基酸。推测的大黄鱼Ⅰ型IFN氨基酸序列N端含有20个氨基酸的信号肽,其后包含一个保守的IFabd结构域。大黄鱼Ⅰ型IFN基因包含5个外显子,4个内含子,在大多数组织和细胞中都有表达,其中在血细胞中表达量最高,肌肉中表达量最低。PolyI:C刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏、头肾和肝脏中的表达量显著上调;LPS刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏和肝脏中的表达量显著上调;灭活的副溶血弧菌可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在头肾和肝脏中的表达量显著上调。

大黄鱼(Larimichthys crocea)fAFLP方法的建立

以大黄鱼为材料,探索及优化了影响荧光标记AFLP(fAFLP)分析体系的主要因素.结果表明:内切酶EcoRⅠ与MseⅠ各0.35 U,双酶切350 ng大黄鱼基因组DNA,依次反应4 h可得最佳效果;T4DNA连接酶2.5 U,16℃过夜连接3μL酶切产物与接头时效果最佳;以1μL连接产物作底物,EcoRⅠ与MseⅠ预扩引物分别为0.3μmol/L与1.5μmol/L时预扩效果最佳;预扩产物稀释超过100倍作为选择性扩增的模板时致使某些样品的电泳条带缺失.使用该体系分析了一个野生大黄鱼群体的AFLP片段的多态水平,结果证明该方法简便有效,可用于群体遗传多态性分析.

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P<0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。