基于mTOR信号通路探讨首乌丸对D-半乳糖衰老大鼠海马神经元突触可塑性的影响

目的:探讨首乌丸基于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对D-半乳糖衰老大鼠海马神经元突触可塑性的影响。方法:将50只SPF级SD雄性大随机分为正常组、模型组、维生素E组、首乌丸低剂量组及首乌丸高剂量组,除正常组外,其余4组均用D-半乳糖(120 mg·kg^(-1))制造衰老模型,同时给予维生素E(0.018 g·kg^(-1)),首乌丸低、高剂量(1.08、2.16 g·kg^(-1))灌胃。造模6周后Morris水迷宫检测行为学变化,取全脑、海马组织,免疫组化检测海马突触后密度蛋白-95(PSD-95)、突触素(SYN)的表达,高尔基染色观察大鼠神经元形态及功能的变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织中mTOR、磷酸化(p)-mTOR、p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、磷酸化(p)-p70S6K、真核翻译起始因子4E结合蛋白2(4EBP2)、磷酸化(p)-4EBP2蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测海马mTOR、p70S6K、4EBP2 mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠平均游泳速度减慢(P<0.01),游泳总路程延长(P<0.05),上平台潜伏期延长(P<0.01),穿越平台次数明显减少(P<0.01),海马CA1区PSD-95、SYN蛋白表达下降(P<0.01),染色效果最淡,区域最小,在同心圆距胞体100、140、180、200μm时,海马神经元树突与同心圆交点数量减少(P<0.01),树突棘长度及密度均下降(P<0.01),p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达升高(P<0.01),4EBP2、p-4EBP2蛋白表达显著下降(P<0.01),mTOR、p70S6K mRNA表达上升(P<0.01),4EBP2 mRNA表达降低(P<0.01)。与模型组比较,首乌丸低、高剂量组大鼠的平均游泳速度加快(P<0.01),上平台潜伏期缩短(P<0.01),穿越平台次数增加(P<0.01),海马CA1区PSD-95、SYN蛋白表达升高(P<0.01),在同心圆距胞体100、140、180、200μm时,海马神经元树突与同心圆交点数量增加(P<0.01),首乌丸低、高剂量组大鼠的树突棘数量、长度、密度均升高(P<0.01),p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达下降(P<0.01),4EBP2、p-4EBP2蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),mTOR、p70S6K mRNA表达降低(P<0.01),4EBP2 mRNA表达显著升高(P<0.01)。结论:首乌丸能够改善D-半乳糖模型大鼠的学习记忆能力,增强突触可塑性相关蛋白表达,改善神经元形态,修复神经功能,减少神经元凋亡,抑制mTOR信号通路,延缓脑衰老。

基于PI3K/Akt通路探讨首乌丸对D-半乳糖衰老大鼠海马神经元凋亡的影响

目的:探讨首乌丸通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路对D-半乳糖衰老大鼠海马神经元凋亡的影响。方法:将SPF级SD雄性大50只随机分为正常组、模型组、维生素E组、首乌丸中剂量组及首乌丸高剂量组,除正常组外,其余4组均用D-半乳糖(120 mg·kg^(-1))制造衰老模型,同时首乌丸中、高剂量组用首乌丸(1.08、2.16 g·kg^(-1))进行灌胃,维生素E组予以维生素E(0.018 g·kg^(-1))灌胃。造模6周后取全脑、海马组织,尼氏染色观察海马神经元形态学变化,原位末端标记法(TUNEL)检测海马细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),磷酸化(p)-PI3K,蛋白激酶B(Akt),p-Akt、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、叉头框蛋白O3a(FoxO3a)、p-FoxO3a、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测海马FoxO3a mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠海马神经元凋亡阳性细胞明显增多,凋亡指数显著升高(P<0.01),海马CA1区尼氏染色显示海马神经元丢失、排列稀疏,尼氏体数量减少,存在尼氏体固缩和深染,p-PI3K、p-Akt、Caspase-3蛋白相对表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著升高(P<0.01),FoxO3a、p-FoxO3a蛋白相对表达、p-FoxO3a/FoxO3a显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01),Bax蛋白表达显著升高(P<0.01),FoxO3a mRNA表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,经首乌丸治疗后,凋亡阳性细胞明显减少,细胞凋亡指数显著降低(P<0.01),海马CA1区尼氏染色显示各治疗组神经元丢失好转,尼氏体增多,排列较密集,大鼠PI3K、Akt蛋白表达差异无统计学意义,首乌丸中、高剂量组的p-PI3K、p-Akt、Caspase-3蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著降低,FoxO3a、p-FoxO3a蛋白表达、p-FoxO3a/FoxO3a显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.01),Bax蛋白表达显著降低(P<0.01),Foxo3a mRNA表达显著升高(P<0.01)。结论:首乌丸能够改善海马神经元组织结构,抑制PI3K/Akt信号通路,下调Caspase-3蛋白表达,激活FoxO3a,上调Bcl-2,下调Bax,上调Bcl-2/Bax,从而减少神经元细胞凋亡。

首乌丸对衰老大鼠肝肾组织的作用及机制研究

目的观察首乌丸对D-半乳糖致衰大鼠肝肾组织中SIRT1、p53、p21、FoxO4、DNMT1的影响,以探讨首乌丸延缓衰老的作用及可能机制。方法大鼠随机分为正常组、模型组、首乌丸组、维E组。模型组、首乌丸组、维E组用D-半乳糖造成衰老模型,造模同时首乌丸组以首乌丸混悬液灌胃,维E组以维生素E混悬液灌胃,正常组、模型组予等量生理盐水灌胃,连续6周。HE染色观察肝肾组织病理改变,三标免疫荧光染色观测大鼠肝肾组织p53、p21、SIRT1的表达,WB检测大鼠肝肾组织FoxO4的蛋白表达量,qPCR检测大鼠肝肾组织DNMT1 mRNA的表达。结果首乌丸可明显改善衰老大鼠肝细胞的脂肪变性以及肾脏结缔组织增生、肾小管扩张等病理改变。同时提高衰老大鼠肝肾组织中SIRT1阳性率,降低p53阳性率及p21阳性率,降低FoxO4蛋白表达量,促进DNMT1mRNA的表达。结论首乌丸可能通过上调肝肾组织中SIRT1的水平,抑制p53、p21及FoxO4的表达,促进衰老细胞凋亡,增强细胞的活性,同时上调DNMT1表达以增强肝肾组织的DNA甲基化水平,从而延缓衰老。