疏风宣肺解毒方抗病毒的实验研究

目的通过现代实验学方法对疏风宣肺解毒方体内外抗流感病毒的实验观察,探讨疏风宣肺解毒方抗流感病毒的实验依据。方法接种流感病毒FM1株于MDCK细胞(狗肾细胞),观察疏风宣肺解毒方体外抗流感病毒的作用;小鼠鼻腔内接种含流感病毒的鸡胚尿囊液,观察疏风宣肺解毒方对病毒感染小鼠死亡率、存活时间、肺指数和肺病变程度的影响。结果疏风宣肺解毒方中、高剂量组对感染流感病毒MDCK细胞有一定的保护作用;疏风宣肺解毒方中、高剂量组与流感模型组比较,在降低病毒感染小鼠死亡率、延长平均存活天数方面差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),并能明显改善病毒感染小鼠的肺指数和肺病变程度(P<0.05或P<0.01)。结论疏风宣肺解毒方具有良好的抗病毒作用。

疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠基因表达谱的影响

目的:采用基因表达谱芯片技术筛选疏风宣肺解毒方治疗流感病毒感染小鼠相关的差异表达基因,初步探讨方药治疗流感的作用机制。方法:流感病毒肺适应株FM1滴鼻感染小鼠,建立小鼠流感病毒性肺炎模型,方药灌胃治疗4 d,提取肺组织总RNA,与小鼠全基因表达谱芯片杂交后进行检测。对筛选得到的药物治疗过程中的差异表达基因进行生物信息学分析。结果:基因芯片结果显示,与模型组相比,给药组表达量发生变化的基因中上调的有2 659条,下调的有2 216条。结论:疏风宣肺解毒方作用涉及免疫学方面的分子功能为:胞内信号级联放大效应,浆膜、免疫应答、细胞增生的调节,免疫防御及细胞程序性死亡等;主要调节的代谢途径有:丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、肿瘤信号通路、toll样受体信号通路、信号转导及转录激活因子途径、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用及趋化因子信号通路等。

疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠肺组织Toll样受体3通路的影响

目的 观察疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠肺组织Toll样受体3（TLR3）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）表达的影响.方法 选择60只SPF级雄性ICR小鼠,按随机数字表法分为正常对照组（N）、模型组（M）、达菲对照组（C）、疏风宣肺解毒方（由菊花、桑叶、杏仁、桔梗、连翘、柴胡等组成）小、中、大剂量组（SL、SM、SH）.采用0.05 mL 4LD50流感病毒FM1稀释液给小鼠滴鼻制备流感病毒感染肺炎小鼠模型;正常对照组用0.05 mL生理盐水滴鼻.制模后2 h,正常对照组、模型组给予蒸馏水;达菲对照组给予磷酸奥司他韦（达菲）2.5 g·mL-1·d-1;疏风宣肺解毒方小、中、大剂量组分别灌服疏风宣肺解毒方药1.0、1.9、3.8 g·mL^-1·d^-1（按照人与小鼠体表面积换算给药剂量）.采用基因芯片分析技术筛选TLR3介导的MAPK信号转导通路相关靶基因;通过实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定TLR3、JNK、p38MAPK的mRNA表达水平.结果 与正常对照组比较,模型组差异基因Tlr3、Mapk8、Mapk13表达明显上调,log2（M/N）分别为1.95、1.82、1.39,疏风宣肺解毒方各组Tlr3、Mapk8、Mapk13均显著下调,大剂量组log2（SH/M）分别为-0.72、-1.14、-1.89,中剂量组log2（SM/M）分别为-2.02、-2.47、-2.27,小剂量组log2（SL/M）分别为-1.43、-2.05、-2.10.RT-PCR结果显示：模型组TLR3、JNK、p38MAPK的mRNA表达水平均较正常对照组显著升高〔TLR3（2-ΔΔCt）：5.63±0.24比1.02±0.13,JNK（2-ΔΔCt）：4.27±0.13比1.02±0.09,p38MAPK（2-ΔΔCt）：5.90±0.48比1.01±0.11,均P〈0.05〕,达菲对照组和疏风宣肺解毒方小、中、大剂量组TLR3、JNK、p38MAPK的mRNA表达均较模型组明显降低〔TLR3（2-ΔΔCt）：2.16±0.33、2.92±0.32、2.71±0.27、3.05±0.16比5.63±0.24,JNK（2-ΔΔCt）：2.02±0.62、2.89±0.33、2.18±0.19、3.18±0.50比4.27±0.13,p38MAPK（2-ΔΔCt）：1.97±0.92、1.72±0.43、2.34±0.64、3.03±0.75比5.90±0.48,均P〈0.05〕.结论 疏风宣肺解毒方可通过抑制以TLR3介导的MAPK信号转导通路中JNK和p38MAPK的过度活化对肺组织炎症损伤产生拮抗作用.

自拟疏风解毒方联合卡泊三醇软膏治疗银屑病的疗效及对免疫功能的影响

目的观察自拟疏风解毒方联合卡泊三醇软膏治疗银屑病的效果及对患者免疫功能的影响,为临床治疗银屑病提供参考。方法选取2019年2月—2022年11月瑞安市中医医院诊治的60例银屑病患者,应用随机数字表法分成2组,每组30例。对照组给予局部涂抹卡泊三醇乳膏^(+)窄谱中波紫外线(NB-UVB)照射干预,观察组在对照组基础上,口服自拟疏风解毒方治疗。2组治疗疗程均为8周。通过银屑病皮损面积与严重程度指数(PASI)评分评估临床效果,并对比2组患者治疗前后的中医证候积分、免疫功能(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))水平变化和安全性。结果治疗后,观察组总有效率为96.67%(29/30),明显高于对照组的73.33%(22/30),χ2=4.706,P=0.030;治疗后,观察组瘙痒剧烈、点状出血、皮疹增多积分均低于对照组(均P<0.01);治疗后,观察组PASI评分均低于对照组(均P<0.01);治疗后,观察组患者外周血CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平均高于对照组[(52.86±6.13)%vs.(45.48±5.57)%,(53.42±5.76)%vs.(48.19±5.24)%,1.90±0.35 vs.1.62±0.39,t=4.880、3.679、2.927,均P<0.01];而CD8^(+)低于对照组[(28.25±5.35)%vs.(31.43±5.07)%,t=2.363,P=0.011]。结论自拟疏风解毒方联合卡泊三醇软膏治疗银屑病疗效显著,可有效降低PASI评分及中医证候积分,其机制可能与调节患者免疫功能有关,且安全性好。

疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠炎性细胞因子的影响

目的:通过基因芯片技术分析疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠炎性细胞因子差异表达基因的影响。方法:按随机数字表法将雄性ICR小鼠分为正常组(N组)、流感病毒性肺炎模型组(M组)、奥司他韦对照组(C组)及疏风宣肺解毒方高、中、低剂量组(SH、SM、SL组),每组10只。通过流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1(0.05 mL)滴鼻建立小鼠流感病毒性肺炎模型;N组以0.05 mL生理盐水滴鼻。SH、SM、SL组于滴鼻感染后2 h灌胃疏风宣肺解毒方,含药浓度分别为临床用药的2倍量、等量、1/2量(约为3.8、1.9、1.0 kg/L),每日1次,每次0.2 mL,连用4 d;C组灌服奥司他韦2.5 kg/L;N组和M组灌服蒸馏水。第5天取小鼠全肺,提取肺组织总RNA,与小鼠全基因芯片杂交并检测,筛选参与炎症相关通路中的靶基因。扫描杂交芯片,计算芯片探针信号在各组与M组的强度表达比值,筛选差异表达基因,其中P<0.05且log2比值>1为上调基因,P<0.05且log2比值<-1为下调基因。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测白细胞介素(IL-1、IL-8)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的mRNA表达。结果:与N组相比,M组差异基因表达IL-1、IL-8、ICAM-1明显上调(log2N组/M组分别为2.62、2.07、1.41,均P<0.05)。与M组相比,SH、SM、SL、C组差异基因表达IL-1、IL-8、ICAM-1均明显下调(log2SH组/M组分别为-1.91、-1.85、-0.88,log2SM组/M组分别为-3.10、-1.74、-1.84,log2SL组/M组分别为-1.89、-1.39、-0.53,log2C组/M组分别为-2.46、-1.52、-1.44,均P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,M组IL-1、IL-8、ICAM-1的mRNA表达水平均较N组显著升高〔IL-1(2^-ΔΔCT):4.63±0.24比1.01±0.13,IL-8(2^-ΔΔCT):6.28±0.13比1.02±0.09,ICAM-1(2^-ΔΔCT):2.90±0.18比1.02±0.12,均P<0.05〕。SH、SM、SL和C组IL-1、IL-8、ICAM-1的mRNA表达水平均较M组组显著降低〔IL-1(2^-ΔΔCT):2.12±0.32、1.71±0.07、2.05±0.16、1.66±0.13比4.63±0.24,IL-8(2^-ΔΔCT):3.89±0.13、2.08±0.19、2.98±0.20、2.02±0.12比6.28±0.13,ICAM-1(2^-ΔΔCT):1.72±0.93、1.34±0.14、1.53±0.25、1.17±0.12比2.90±0.18,均P<0.05〕,但SH、SM、SL和C组间差异无统计学意义。结论:疏风宣肺解毒方通过下调IL-1、IL-8、ICAM-1炎性细胞因子相关基因的表达,抑制流感病毒感染后小鼠的炎症损伤。

流感病毒对小鼠肺部趋化因子通路的影响及疏风宣肺解毒方药的干预作用

目的通过基因芯片技术筛选流感病毒感染小鼠肺部趋化因子通路的差异表达基因,并探讨疏风宣肺解毒方药的干预作用。方法按照随机数字表法将雄性ICR小鼠分为对照组(N组)、流感病毒感染模型组(M组)、盐酸奥司他韦对照组(C组)及疏风宣肺解毒方药大、中、小剂量组(SH、SM、SL组),每组10只。应用流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1(0.05 mL)滴鼻制备小鼠流感病毒性肺炎模型;N组给予0.05 mL生理盐水滴鼻作为对照。SH、SM、SL组在滴鼻感染2 h后应用疏风宣肺解毒方药灌胃,分别为临床治疗剂量的2倍量、等量和1/2量(约为3.8、1.9、1.0 g·mL^(-1)·d^(-1)),连用4 d;C组灌胃盐酸奥司他韦2.5 g·mL^(-1)·d^(-1);N组和M组灌胃蒸馏水(每日1次、每次0.2 mL)作为对照。于实验第5天取小鼠全肺,计算肺指数,并进行病理切片观察;提取肺组织总RNA,与小鼠全基因芯片杂交,对检测数据进行聚类分析,筛选出趋化因子通路的相关靶基因。扫描杂交芯片,计算芯片探针信号在各给药组与M组的表达强度比值,筛选出差异表达基因,其中P<0.05且log2比值>1为上调基因,P<0.05且log2比值<-1为下调基因。结果与N组比较,M组小鼠肺指数明显升高,且肺组织出现病理学改变,提示流感病毒感染模型制备成功。与M组比较,C组、SH组、SM组、SL组肺指数均明显降低(0.96±0.14、1.45±0.22、1.14±0.18、1.22±0.21比1.72±0.15,均P<0.05),且肺组织病理学改变范围及程度均减轻;但各给药组间无明显差异。基因芯片检测结果显示,N组与M组、SH组与M组、SM组与M组、SL组与M组各组间差异表达基因数量较多。代谢途径富集分析筛选出上述差异表达基因主要富集于趋化因子信号通路;与N组比较,M组上调的差异表达基因主要有趋化因子C-C亚族配体(CCL-3、CCL-5)和趋化因子C-X-C亚族配体(CXCL-9、CXCL-10),log2(M组/N组)分别为6.64、3.51、5.40、6.64;与M组比较,盐酸奥司他韦和疏风宣肺解毒方药各组差异表达基因CCL-3、CCL-5、CXCL-9、CXCL-10均下调,log2(C组/M组)分别为-3.96、-2.26、-3.12、-2.40,log2(SH组/M组)分别为-5.57、-2.37、-1.57、-1.01,log2(SM组/M组)分别为-4.35、-1.47、-1.26、-1.74,log2(SL组/M组)分别为-2.86、-1.86、-1.23、-1.39。结论疏风宣肺解毒方药可通过下调趋化因子的表达水平缓解小鼠的肺部炎症损伤。