H5亚型不同分支禽流感病毒HA基因混编文库的构建

为探究DNA Shuffling能否用于H5亚型不同分支禽流感病毒(AIV)HA基因混编文库的建立,以及利用该基因文库构建重组牛痘病毒文库的可行性,本研究构建了包含H5亚型AIV 2.3.4.4分支代表株A/Chicken/Guizhou/S4184/2017(H5N6)(简称GZ/S4184)和2.3.2.1d分支代表株A/Chicken/Liaoning/SD007/2017(H5N1)(简称LN/SD007)HA基因的重组质粒pRB-GZ/S4184HA和pRB-LN/SD007HA,并经PCR鉴定正确后分别作为模板经PCR扩增两种病毒的HA基因,并利用DNaseⅠ消化后,选择两种病毒10 bp~50 bp的HA基因等质量混合后作为模板,经Shuffling PCR混编后,选取弥散条带大量集中在2000 bp左右的Shuffling PCR产物为模板经特异性PCR扩增两种AIV的混编HA(mHA)基因。结果显示,获得2000 bp左右的mHA基因,且与从上述两种重组质粒扩增的HA基因片段大小基本一致。将mHA基因克隆至pRB21质粒中,构建pRB21-mHA质粒文库,并经PCR鉴定和测序分析其多样性。结果显示,随机挑选200个菌落检测pRB21-mHA质粒文库的阳性率为92.5%,且均呈现2种亲本病毒HA基因的碱基特性且均不相同,表明构建了HA基因序列呈现多样性的pRB21-mHA质粒文库。利用pRB21-mHA质粒文库转染预先感染缺陷牛痘病毒(rdVV-ΔVP37)的CV-1细胞,构建重组牛痘病毒(rVV-mHA)库,并分别经PCR、测序和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。结果显示,随机挑选的200个病毒噬斑,检测重组牛痘病毒库rVV-mHA的阳性率为96%;且其mHA基因编码的氨基酸序列均呈现出2种亲本病毒HA基因的氨基酸序列特性且均不相同;IFA鉴定结果显示,mHA基因均能够通过重组牛痘病毒在细胞中正确表达。以上结果表明,利用Shuffling PCR技术获得了同时呈现H5亚型AIV GZ/S4184和LN/SD007株HA基因特性的pRB21-mHA质粒文库和rVV-mHA库。本研究首次基于H5亚型不同分支AIV的HA基因,利用DNA Shuffling技术建立了Shuffling PCR方法用于构建AIV的mHA基因文库,并利用该基因文库构建重组牛痘病毒文库,为后续相关研究奠定了物质和技术基础。