益艾康联合逆转录病毒疗法治疗SIV感染猕猴艾滋病模型实验研究

目的 采用猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)感染猕猴艾滋病模型,评价中药益艾康联合抗逆转录病毒治疗(ART)的治疗效果。方法 8只SIVmac239病毒感染的猕猴随机分为两组:ART治疗组、益艾康联合ART治疗组。ART治疗先后分别使用洛匹那韦/利托那韦(LPV/r)和恩曲他滨(FTC)+泰诺福韦(PMPA)+雷特格韦(RAL)进行治疗,检测不同治疗时期猕猴体质量、血常规、血生化、血浆病毒载量以及CD4+T细胞和CD8+T细胞计数及各亚群的变化情况。结果 在LPV/r治疗期,LPV/r单独治疗组的血红蛋白在治疗1、2周时明显降低,随后恢复到治疗前水平(P<0.05),益艾康联合LPV/r治疗组则无显著变化(P>0.05);两组动物的肌酐在治疗期间逐渐升高(P<0.05),组间差异无统计学意义(P>0.05);LPV/r单独治疗组的γ-谷氨酰转肽酶在各时间点均高于益艾康联合LPV/r治疗组,但差异无统计学意义(P>0.05);益艾康联合LPV/r治疗组PD-1^(+)CD_(4)^(+)T细胞百分比治疗后升高(P<0.05),LPV/r单独治疗组无明显变化(P>0.05),益艾康联合LPV/r治疗组PD-1^(+)CD_(4)^(+)T细胞百分比在治疗期间均低于LPV/r单独治疗组,但差异无统计学意义(P>0.05);益艾康联合LPV/r治疗组na6ve CD_(4)^(+)T细胞百分比治疗后降低(P<0.05),LPV/r单独治疗组na6ve CD_(4)^(+)T细胞百分比无明显变化(P>0.05);益艾康联合LPV/r治疗组CD4+Tcm细胞百分比治疗后升高(P<0.05),LPV/r单独治疗组CD_(4)^(+)Tcm细胞百分比无明显变化(P>0.05);使用FTC+PMPA+RAL治疗后,治疗组血浆病毒载量在治疗1周时下降1.80 log10copies/mL,益艾康联合FTC+PMPA+RAL治疗组下降2.40 log10copies/mL,均下降到检测线(1.47 log10copies/mL)以下,停药1周时未见血浆病毒载量反弹,停药2周时益艾康联合FTC+PMPA+RAL治疗组血浆病毒载量出现反弹为2.33 log10copies/mL,FTC+PMPA+RAL治疗组未见反弹,停药3周后两组均出现血浆病毒载量反弹。结论 研究结果表明益艾康联合LPV/r治疗SIVmac239感染猕猴艾滋病模型对体质量及血常规影响较小,可减轻LPV/r造成的肝损伤;可减缓CD_(4)^(+)T细胞计数降低、降低PD-1^(+)CD_(4)^(+)T细胞表达、促进na6ve CD_(4)^(+)T细胞向CD_(4)^(+)Tcm细胞分化调节免疫功能;益艾康联合FTC+PMPA+RAL治疗对感染猴血液常规参数无显著影响,不会对感染猴血浆病毒载量抑制及反弹产生影响。

海洋硫酸多糖911抗艾滋病毒作用及其机理研究——体内对猴免疫缺陷病毒(SIV)增殖的影响

采用体外细胞培养技术和病毒体内感染模型 ,通过 Elisa、定量 PCR、流式细胞术等方法 ,研究了海洋硫酸多糖 911体外对 HIV- 1复制及体内对 SIV增殖的影响 ,并初步探讨其作用机制。结果发现 911可明显抑制HIV- 1对 MT4 细胞的急性感染和 H9细胞的慢性感染 ,其半数有效浓度 ( EC50 )分别为 4 .4 4 mg· L-1和 0 .32mg· L-1;并可明显降低猴血浆中病毒滴度及 RNA拷贝数 ,对血液中 CD4 +细胞具有一定的保护作用 ,同时可升高血液中病毒抗体的含量 ;并可明显抑制病毒逆转录酶活性 ,对 HIV- 1无明显直接灭活作用 ,但可明显干扰 HIV- 1与细胞的吸附 ,半数有效浓度 ( IC50 )为 36.51μg· L-1。提示 911体内外均可抑制艾滋病毒的增殖 ,为高效的艾滋病毒增殖抑制剂 ,其作用机制与干扰病毒与细胞吸附、抑制病毒逆转录酶活性有关。

猴免疫缺陷病毒（SIV）猴模型的建立

应用ＳＩＶｍａｃ毒株感染中国恒河猴１３只，感染剂量为病毒液的１０－１～２×１０－５；感染食蟹猴４只，感染剂量为１０－２。感染后２周出现各种症状和体征如皮疹，浅表淋巴结肿大，脾肿大，血象白细胞总数下降，出现异常淋巴细胞和中性白细胞。感染后期Ｔ４下降，Ｔ４、Ｔ８比例倒置等。从外周血淋巴细胞和血浆分离病毒阳性，血清抗体上升。淋巴结组织切片呈规律性改变，即淋巴滤泡增生－滤泡耗竭－淋巴组织耗竭或逐渐恢复。感染后２．５个月有急性死亡病例，以后呈散在死亡例，尸检还发现机遇性感染如肺寄生虫，肺、肝巨细胞病毒感染等。

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。

20Mn2SiV非调质钢热变形流变应力模型

利用MMS-300热模拟试验机,对20Mn2SiV非调质钢在变形温度为900~1 100℃及应变速率为0.01~10s-1条件下的流变应力进行了研究,讨论了Z参数与动态再结晶之间的关系,并建立了该钢的热变形流变应力模型.结果表明：采用Z参数可以判断动态再结晶发生与否,当lnZ≤32.76时,20Mn2SiV非调质钢发生动态再结晶;根据动态再结晶发生与否以及应变是否达到动态再结晶临界应变值,分别建立了不同情况下的流变应力模型,模型拟合效果良好.

TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法检测SIV/SHIV病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒的RNA拷贝数。方法利用TaqMan探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,通过对本室SIV/SHIV病毒RNA定量外标准品RS的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果该方法检测灵敏度可达4.60×101copies/μL,特异性及重复性良好,对同一样品进行16次重复检测,其循环阈值的平均标准偏差为0.066。结论TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)及SHIV病毒RNA载量。

SIVp27抗原双抗体夹心ELISA检测方法的研究

目的建立检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。方法使用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中的SIVp27单抗,用过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。经抗体配对实验确定包被抗体和检测抗体,再用棋盘滴定法确定抗体工作浓度后,探索构建检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA法。应用建立的双抗体夹心ELISA法,对SIV模型猴血浆标本和SHIV模型猴病毒分离培养上清标本进行了检测,并将其结果与Coulter公司试剂盒检测结果进行比较。结果以稀释至20ug/mL的2E12为包被抗体、1:400稀释的酶标3G3为检测抗体为ELISA最优体系。模型猴血浆标本和病毒分离培养上清标本的检测结果表明自建体系可以用于SIVp27抗原的检测,特异性良好,灵敏度略低于Coulter公司试剂盒。结论检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法初步建成,为研制有独立知识产权的检测试剂奠定了一定的基础。

ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的为了完善现有的SIV/恒河猴模型,掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态,为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考,我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平。方法实验前选出4只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴,使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法,监测SIVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况,持续测定一年。结果实验结果显示IFN-γELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况,IFN-γELISPOT结果和CD4+T细胞数无相关性,与血浆病毒载量稍有相关。结论本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围,了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系,完善了SIV/SAIDS模型评价指标,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件。

猴免疫缺陷病毒（SIV）分离鉴定方法的实验研究

人，外周血淋巴细胞(HuPBLs)和CEMx174细胞分离SIV的分离率均为100％，但细胞病变(CPE)出现时间及CPE程度和IFA强度均不一样，HuPBLs细胞CPE出现较快，而CPE程度和IFA强度均不如CEMx174细胞明显；CEMx174细胞CPE出现较晚，但CPE明显，IFA强度大．不同的标本、不同的时期，同一标本不同的接种量，病毒分离的结果均表现出规律性变化，说明方法学的可靠性，同时也说明两种细胞均可用于SIV的病毒分离。

猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。

SIVmac251不同途径感染恒河猴急性期实验研究

目的建立SIV黏膜感染的恒河猴模型,并与静脉感染相比较,研究不同途径感染后病程进展是否存在差异。方法用SIVmac251经静脉、阴道、直肠3种途径分别感染恒河猴,定期采血,进行全血病毒分离,测定血浆病毒载量、CD4+/CD8+比值及抗体检测。结果感染后7d至目前56d为止,外周血单核淋巴细胞中前病毒DNA检测、全血病毒分离全部呈现阳性,只有直肠感染猴S172在7d和42d时出现较高病毒滴度;血浆病毒载量检测阳性出现先后顺序为静脉感染、直肠感染、阴道感染,14d达到高峰,然后迅速下降,变化趋势基本保持一致。血浆抗体检测从第14天开始3种途径感染的恒河猴体内抗体均为阳性;感染后CD4+/CD8+比值下降,在第28天时出现比例倒置。结论经不同途径均成功感染恒河猴后在病毒分离和血浆病毒载量等方面表现出了一定的差异。

SIV p27单克隆抗体的制备和鉴定

目的建立SIVp27杂交瘤细胞株，并对其分泌的SIVp27单克隆抗体进行初步鉴定。方法使用基因重组的SIVp27蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术使用半固体培养基法建立杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体。通过染色体核型对杂交瘤细胞株进行鉴定；采用Western blot、免疫荧光法、酶联免疫吸附法确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、抗原识别表位、免疫球蛋白的类型和亚类。对单克隆抗体进行鉴定。结果获得4株可稳定分泌SIVp27单克隆抗体的杂交瘤细胞，IC3、286为IgG1类，2E12为IgG2b类，3G3为IgG2a类。4株单抗均能识别SIV的p27蛋白，与逆转录病毒SRV、STLV无交叉反应，286、2E12与H1Vp24有交叉反应。免疫荧光法检测腹水效价为1：10240～1：40960。1C3、286、2E12、3G3染色体平均数分别为103、97、96、101。2E12与3G3识别不同的抗原表位。结论成功地制备出4株SIVp27单克隆抗体，均具有良好的特异性和亲和力，为进一步建立免疫分析方法，进行SIV／SAIDS及其艾滋病相关研究，奠定了基础。

中药1号治疗SIVmac感染猴和艾滋病模型猴的观察

中药１号治疗ＳＩＶｍａｃ感染猴２只，给药６周。结果：治疗组病毒血症在感染后４周消失，对照组病毒血症持续至１４周。淋巴结病理组织学显示，治疗组淋巴结滤泡数量较多，淋巴组织修复较好，结构基本保持原来状态。对照组淋巴结滤泡数量减少，并有滤泡耗竭现象。中药１号治疗模型猴２只，给药８周。结果：病毒学检查治疗和不治疗的猴无差异。淋巴结病理组织学表明，治疗猴淋巴结的结构和滤泡有明显修复现象。对照猴淋巴滤泡大量减少，出现滤泡耗竭和纤维化现象，并死亡１只。

一类具有非线性传染率和脉冲接种的SIV传染病模型

研究了一类具有脉冲预防接种且带有非线性传染率的SIV传染病模型,并考虑了人口总数变化,与总人口量有关的自然死亡率以及因病死亡率的因素,证明了无病周期解的存在性,得到了基本再生数.通过脉冲微分方程的F loquet理论得出无病周期解局部渐近稳定,并利用比较定理进一步推出无病周期解全局渐近稳定.

中研Ⅱ号对猴感染SIVmac251T细胞亚群及β_2-微球蛋白变化的实验研究

目的:应用中药中研号复方对感染SIVmac251恒河猴实验观察T淋巴细胞亚群及β2-MG变化。方法:对猴免疫缺陷病毒SIVmac251感染动物实验研究,通过中研号复方对感染动物及治疗后转归影响,检测猴血清β2-MG含量变化及外周血中CD4+T细胞百分数改变,观察中研号对模型动物免疫调节作用。结果:中研号复方能够降低感染动物血清β2-MG含量,并能提高动物CD4+T细胞百分数。结论:中研号对SIV感染动物免疫功能具有保护作用。

游离SIVmac239病毒与T细胞介导两种方式感染内皮细胞的效果比较

目的比较游离病毒感染与T细胞介导的感染方式对SIV感染内皮细胞的影响,探索SIVmac239感染内皮细胞的主要途径,从而为SIV入侵血脑屏障的机制提供理论基础。方法采用游离SIV病毒直接感染内皮细胞和SIV感染的CEMx174细胞与内皮细胞共培养的两种方式,通过巢式PCR、间接免疫荧光法、Western blotting以及ELISA检测内皮细胞的感染程度。结果两种感染方式都能在内皮细胞内检测到前病毒DNA,感染细胞与内皮细胞共培养时,内皮细胞内前病毒DNA含量,SIV P27蛋白表达量和细胞培养上清液中P27含量远高于游离病毒直接感染的方式。结论细胞介导的感染方式相较于游离病毒直接感染方式对内皮细胞的感染能力更强,可能是SIV病毒入侵血脑屏障的主要途径。

大黄蒽醌联合荔枝核黄酮干预SIV/CEMx174细胞的蛋白组学研究

目的:观察大黄蒽醌联合荔枝核黄酮类化合物体外抗猴艾滋病病毒(SIV)与模型组差异蛋白质的表达。方法:建立艾滋病病毒模型,利用大黄及荔枝核提取大黄蒽醌及荔枝核黄酮类化合物共同作用于猴CEMx174细胞48h后,提取两组细胞的总蛋白,利用iTRAQ技术筛选出表达的差异蛋白,并且利用GO数据库对差异蛋白进行富集度分析和注释以及对KEGG数据库进行信号转导通路的分析。结果:大黄蒽醌联合荔枝核黄酮组鉴定出116个特异蛋白,模型组鉴定出121个特异蛋白,两组的差异蛋白20个,其中5个蛋白表达上调,15个蛋白表达下调。GO数据库分析显示差异蛋白主要参与了蛋白、RNA、DNA等结合的分子功能,主要参与了免疫反应、信号转导、病毒感染、细胞凋亡的生物过程,细胞组件主要存在于细胞质、细胞膜、细胞核、胞外体上。KEGG分析显示差异蛋白主要参与了癌症通路、病毒致癌作用、肺结核、EB病毒感染、梅毒感染、补体途径、炎症介质的调节、调控细胞自噬通路等相关信号通路。结论:iTRAQ技术能够快速地筛选出差异蛋白,结合GO、KEGG分析能够以整体观阐释大黄蒽醌类联合荔枝核黄酮类化合物体外抗SIV的作用机制。

抽油杆用钢30Mn2SiV拉伸脆断原因分析

利用扫描电镜研究了30Mn2SiV非调质抽油杆用钢拉伸脆断的原因。结果表明：由于经过轧制后棒材组织产生了内外组织不均匀,即心部组织为铁素体+珠光体和少量上贝氏体的混合组织,而外部则生成大量的上贝氏体组织,晶粒尺寸和形状也变得不规则是造成试样发生脆断的原因。内外组织不均匀是对该钢轧制过程监控不严,内外组织冷却程度不同而造成的。

用相对衰减系数无损表征30Mn2SiV钢的显微组织

采用超声波检测技术无损区分材料不同组织状态的研究近年来已成为热点,以经控轧控冷工艺生产的30Mn2SiV非调质D级抽油杆用钢为对象,采用水浸线聚焦检测技术,借助超声波频谱分析方法,以相对衰减系数为无损表征参量,研究了棒材多相混合组织状态与相对衰减系数之间的关系。结果表明:该钢相对衰减系数值分布规律从大到小排列为含大量上贝氏体组织、片状珠光体+铁素体组织、珠光体球化组织。

SIVmac感染恒河猴诱发猴艾滋病模型的免疫学特征

目的 :研究猴免疫缺陷病毒感染所致的猴艾滋病 (SAIDS)模型的免疫学特性。方法 :采用ELISA方法检测血浆中SIVp2 7抗原水平 ,流式细胞仪检测法分析细胞周期及ELISA方法测定IL 2水平。结果 :感染 2周时血浆病毒滴度达到高峰 ,4周后病毒滴度下降。CD4 +细胞在感染后 2周下降到最低 ,4周时开始部分升高。此外 ,在感染早期SIV感染启动了T细胞对ConA刺激的强反应 ,活化的SIV感染T细胞不能产生IL 2 ,显示感染的T细胞缺乏完整的增殖功能。然而在晚期T细胞对同样的刺激无反应 ,既无反应期 ,显示了极度的免疫缺陷。结论 :提示在感染早期不仅CD4 +细胞数量改变 ,而且显示感染的T细胞功能障碍 。