Sialin(SLC17A5)在腮腺、颌下腺及颌下腺细胞系HSG表达的初步分析

目的研究唾液酸转运蛋白Sialin在正常涎腺组织和颌下腺细胞系HSG的表达。方法应用基因芯片检测正常人腮腺、颌下腺组织Sialin编码基因SLC17A5的表达;提取腮腺、颌下腺组织及颌下腺细胞系(HSG)总RNA,通过RT-PCR在基因水平上验证SLC17A5基因的表达;提取HSG细胞总蛋白,用免疫印迹法检测Sialin在蛋白水平表达。结果基因芯片检测到Sialin编码基因SLC17A5基因在正常人腮腺、颌下腺均有表达,表达比值分别为226、206·9,不存在表达差异;RT-PCR验证芯片结果并在其他涎腺样本及颌下腺细胞系HSG中能扩增出其全部翻译区1485bp的片段,应用商业化的抗体能够在HSG细胞检测到Sialin相应的约54KDa蛋白。结论正常腮腺、颌下腺组织和颌下腺细胞系HSG均表达SLC17A5基因,但是唾液酸转运蛋白Sialin在组织、细胞内定位和功能需要进一步研究。

兔抗人唾液酸转运蛋白抗体的制备及特性鉴定

目的：制备兔抗人唾液酸转运蛋白（sialin）的抗体，并进行特性鉴定。方法：应用RT—PCR从培养的人颌下腺细胞系HSG中扩增编码sialin N端1～38氨基酸的DNA序列，构建重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin，测序鉴定后，转化大肠杆菌JM109，在0．1 mmol／L IPTG的诱导下表达GST—sialin融合蛋白。经SDS-PAGE鉴定后，利用GSTrap FF^TM柱纯化融合蛋白，并以其免疫家兔制备抗人sialin抗体。用ELISA法测定兔抗sialin血清的效价；用Western blot及免疫细胞化学等方法鉴定抗血清的特异性。结果：构建了重组表达质粒pGEX-5X-1-sialin；以其转化大肠杆菌在IPTG诱导下，获得以可溶性形式表达的GST-sialin融合蛋白；表达的GST—sialin经GSTrap FF^TM柱纯化后，免疫家兔制备出抗sialin抗血清，ELISA法测定抗血清的效价为1：32000。Western blot鉴定表明，制备的抗sialin抗体可特异地识别HSG细胞中相对分子质量（Mr）约55000的sialin蛋白。免疫细胞化学检测表明，sialin抗血清识别的抗原定位于HSG细胞的细胞质和胞核。结论：成功地制备出兔抗人sialin抗血清，为进一步研究sialin在涎腺组织的功能奠定了基础。

研究发现细胞膜硝酸盐转运通道

中国科学报报道，日前在国家自然科学基金资助下，首都医科大学教授王松灵课题组与美国国立卫生研究院、北京市肿瘤研究所课题组合作，首次发现哺乳类动物细胞膜的硝酸盐转运通道。相关研究发表在美国《国家科学院院刊》（PNAS）上。硝酸盐是自然界广泛存在的一种无机物，上世纪80年代，学者们发现机体可以内源性产生硝酸盐。尽管硝酸盐与肿瘤的关系一直是学者关注的重要领域，但近年来的研究发现，人体可还原硝酸盐，转化为亚硝酸盐及一氧化氮，从而发挥重要的生理功能。而机体是如何转运硝酸盐并发挥功能的机理尚不清楚。体内循环的硝酸盐经硝酸盐还原为亚硝酸盐，进而产生的一氧化氮在维持全身硝酸根离子和一氧化氮平衡中起着重要作用，机体内25％的硝酸盐是由唾液腺摄取分泌至唾液而进入胃肠血液再循环。王松灵课题组的研究表明，腮腺是机体调节代谢硝酸盐的重要器官。课题组利用唾液腺模式器官，通过国内外合作研究，以体外细胞学、动物实验及唾液酸转运蛋白（Sialin）突变所致疾病患者和对照组研究为基础，发现了Sialin是唾液腺细胞膜硝酸盐的转运通道。进一步研究证实，经Sialin转运的硝酸盐在细胞内可转化为一氧化氮，Sialin在包括脑、肝、肾、脾在内的机体重要脏器广泛高表达，可能具有潜在的生理意义和临床应用前景。细胞内经一氧化氮合成酶产生一氧化氮的功能具有重要临床意义，细胞在乏氧及酸性条件下经合成酶产生的一氧化氮明显减少，会启动补偿性系统，产生一氧化氮来维持细胞的功能。该研究是首次发现哺乳类动物细胞膜的硝酸盐转运通道，在机体硝酸盐循环代谢及在维持亚硝酸盐及一氧化氮稳态方面有重要作用。

低浓度硝酸盐对人血管内皮细胞缺氧复氧损伤保护作用的实验研究

目的以血管内皮细胞缺氧复氧损伤模型作为缺血再灌注损伤的体外研究模型,探究硝酸盐对血管内皮缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立人血管内皮细胞缺氧复氧损伤模型,缺氧时间为3 h,复氧时间为2 h。以CCK-8法验证不同浓度的硝酸钠对血管内皮细胞活性的影响,确定适宜浓度。以10μmol/L作为硝酸钠保护血管内皮细胞缺氧复氧损伤的适宜浓度,以Annexin V-PE/7AAD染色流式细胞法验证细胞凋亡水平的变化,以实时定量PCR和免疫印迹法验证Sialin蛋白及其编码基因SLC17A5的表达水平变化。结果 CCK-8实验证实了在较低浓度的硝酸钠作用下,缺氧复氧损伤后血管内皮细胞活性较对照组(未加硝酸盐组)有显著升高(P<0.05),以10μmol/L作用最为明显。极低浓度(1μmol/L)及较高浓度(50μmol/L,100μmol/L)硝酸钠作用下,细胞活性较对照组无明显差异。10μmol/L硝酸钠作用下,缺氧复氧损伤后血管内皮细胞细胞凋亡水平显著下降(P<0.05),Sialin蛋白及其编码基因SLC17A5的表达水平均有明显升高(P<0.05)。结论低浓度的硝酸盐能够提高血管内皮细胞缺氧复氧损伤后细胞活性,降低其凋亡水平,提示硝酸盐对组织瓣缺血再灌注损伤可能具有保护作用,该作用可能与硝酸盐转运蛋白Sialin有关。

经口腔唾液腺转运的硝酸盐循环对全身健康的重要作用

稳态是机体健康和疾病的交汇点.保持良好的稳态是健康的必要条件,恢复机体的稳态是扭转疾病状态的关键手段.硝酸盐作为一种天然膳食营养素,广泛存在于日常用水及食物中,是生物体存活不可或缺的物质.在病理状态下,外源性补充的硝酸盐可通过硝酸盐-亚硝酸盐-NO途径,作为内源性NO途径的补充,对机体稳态的维持具有重要意义.与此同时,Sialin和硝酸盐之间相互作用也会参与多种细胞稳态的调节进而对全身稳态作出贡献.目前已证实,外源性补充硝酸盐对机体多系统具有保护作用.硝酸盐是维持机体稳态的重要体系,具有良好的临床应用潜力.本文主要综述了硝酸盐的发现历程及研究现状,并阐明了其在未来应用中可能面临的严峻挑战和应对策略,以期为硝酸盐在机体稳态维持和疾病防治中的应用提供新的研究思路.

稳态医学——维持机体健康和诊治疾病的新概念新策略

稳态(homeostasis)是一种自我调节的动态平衡过程, 生物体系统通过这种过程保持系统稳定, 同时适应不断变化的外部条件, 从而维持正常的生命活动。稳态医学是研究生物体分子、细胞、器官及全身稳态平衡的科学, 是以维持稳态平衡为立足点继而维护人体健康、预防和诊疗疾病的综合性学科。稳态医学(homeostatic medicine)着眼于机体整体, 聚焦稳态在健康和疾病中的作用, 有望为维持健康和诊治疾病提供新的思路和策略。一氧化氮(nitric oxide, NO)在机体多系统稳态的调控中发挥重要作用, 硝酸盐可以通过硝酸盐-亚硝酸盐-NO途径调节机体NO发挥重要生理作用以维持机体稳态。存在于细胞膜及细胞内的硝酸盐转运通道唾液酸转运蛋白(sialin)可介导一系列细胞生物学功能, 其与硝酸盐产生的NO一起, 共同成为调控机体稳态的重要机制。

硝酸盐——从口腔走向全身的使者

绿叶蔬菜是饮食硝酸盐的主要来源,饮食硝酸盐由肠黏膜吸收入血。腮腺是机体转运硝酸盐的重要器官,唾液腺通过唾液腺浆液性细胞膜上硝酸盐转运蛋白(sialin)主动摄取血液中的硝酸盐并分泌至唾液。唾液硝酸盐在口腔细菌作用下部分还原为亚硝酸盐及一氧化氮,唾液硝酸盐和亚硝酸盐随吞咽及肠黏膜吸收再次进入循环。硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮途径是体内一氧化氮非经典来源途径,其在生理和病理状态下发挥重要作用,尤其是在低氧和缺血状态下更明显。这些作用包括机体保护(如胃肠、心血管保护)、抗炎、调节糖脂代谢、提高运动能力、维持肠道菌群平衡及延缓衰老等。以往认为硝酸盐对机体有害的观点被证明缺乏科学依据。随着研究和应用的不断深入,硝酸盐作为从口腔走向全身的使者有望在全身健康及疾病防治中发挥重要作用。