雪莲SikCDPK1基因的表达特征和蛋白激酶活性分析

极端生境草本植物天山雪莲中的Sik CDPK1基因可明显提高转基因烟草的低温、干旱耐受性。为探究Sik CDPK1基因的表达特征和蛋白激酶活性,本研究利用实时荧光定量PCR技术检测了Sik CDPK1基因在雪莲不同组织器官的表达水平以及对信号分子CaCl_(2)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA_(3))、水杨酸(SA)、H_(2)O_(2)的诱导响应模式,采用Kinase-GloTM技术检测了SIKCDPK1蛋白激酶活性,利用绿色荧光蛋白(GFP)基因融合蛋白表达法进行了SIKCDPK1蛋白的亚细胞定位。结果显示:Sik CDPK1基因在雪莲根、茎、叶、种子、幼茎、幼叶中均表达,Sik CDPK1基因受CaCl_(2)、ABA、GA_(3)、SA、H_(2)O_(2)的诱导表达但响应模式有差异;激酶活性分析发现Ca^(2+)存在时,SIKCDPK1具有激酶催化活性,加入Ca^(2+)螯合剂EGTA后,SIKCDPK1几乎没有激酶活性。SIKCDPK1激酶活性随Ca^(2+)浓度增加而增加,Ca^(2+)浓度(K0.5)为48.7 nmol·L^(-1)时,SIKCDPK1激酶活性可达到最大活性的1/2;以HisⅢ为底物时,SIKCDPK1的Km值可达到43.8μg·m L^(-1),SIKCDPK1蛋白定位于细胞核。上述结果表明Sik CDPK1基因表达无明显组织特异性,可响应信号分子Ca^(2+)、ABA、GA_(3)、SA、H_(2)O_(2)的诱导;SIKCDPK1发挥蛋白激酶活性需要Ca^(2+),SIKCDPK1主要在细胞核里发挥作用。

启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响

探究逆境诱导启动子RD29A对转雪莲SikCDPK1基因烟草抗逆性的影响,为SikCDPK1基因在植物遭遇低温、干旱时更好发挥作用奠定基础。采用基因重组技术构建RD29A启动子驱动SikCDPK1基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法遗传转化烟草,分别观察、测定和比较分析低温、干旱处理后,RD29A::SikCDPK1转基因烟草、35S::SikCDPK1转基因烟草和非转基因烟草的表型、POD活性、SOD活性、叶绿素含量、MDA含量和相对电导率的差异。结果显示,干旱和低温胁迫后,RD29A::SikCDPK1转基因烟草的生长状况优于35S::SikCDPK1转基因烟草,更优于非转基因烟草;同时,RD29A::SikCDPK1转基因烟草的POD活性、SOD活性、叶绿素含量显著高于35S::SikCDPK1转基因烟草,极显著高于非转基因烟草;但MDA含量与相对电导率显著低于35S::SikCDPK1转基因烟草,极显著低于非转基因烟草。表明启动子RD29A可通过减缓叶绿素降解速率、提高抗氧化系统酶活性、减小膜通透性,使转基因烟草表现出更强的干旱、低温耐受性。