溶藻弧菌抗独特型抗体scFv的原核表达及免疫原性鉴定

目的构建溶藻弧菌抗独特型单链抗体(scFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法从分泌溶藻弧菌抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中已获得的该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建scFv及原核表达载体pET32a-AL,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。结果scFv基因序列全长747碱基对,编码249个氨基酸,符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基。ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。结论成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体scFv原核表达载体并表达于包涵体中,表达的融合蛋白具有与溶藻弧菌一样的免疫原性,为溶藻弧菌抗独特型单链抗体scFv成为鱼用基因工程疫苗奠定了初步基础。

抗乙酰胆碱受体单链抗体与人血清白蛋白融合基因真核表达载体的构建

[目的]构建真核表达体系,提高抗人乙酰胆碱受体单链抗体(ScFv 637)与人血清白蛋白(HSA)融合基因(ScFv 637-HSA)的蛋白表达质量.[方法]扩增ScFv 637-HSA融合基因,经酶切处理后,克隆至真核载体pPIC9 K,线性化处理后,电穿孔入毕赤酵母GS 115.[结果]经电泳观察可见相对分子质量为2.6 kbp的融合蛋白ScFv 637-HSA基因和真核表达载体pPIC9 K基因片段.[结论]ScFv637-HSA基因已准确地整合到毕赤酵母染色体基因组中.

一种新型胃肠道癌特异性单链抗体的表达及其在胃癌中的检测

目的通过原核可溶性表达将我们制备的抗胃肠道肿瘤特异性单链抗体(single chain antibody variable fragment,scFv)基因表达出单链抗体蛋白,初步鉴定并检测其在几种胃癌细胞中的表达。方法通过基因原核表达、Western blot、ELISA等方法检测单链抗体的表达;通过免疫细胞化学方法检测其对几种胃癌细胞的肿瘤相关抗原的识别。结果 获得的单链抗体分子量31 KD,与理论分子量基本一致,并通过Western blot、ELISA加以证实;免疫细胞化学方法证明该单链抗体可识别胃癌细胞KATOⅢ、HGC-27、肝癌细胞SMMC7721等细胞,不能识别SGC7901。结论通过对单链抗体的原核表达,明确了单链抗体对胃癌细胞的识别能力,为进一步临床应用提供理论基础。

单链抗体的表达

单链抗体(scFv)是具有抗体活性的最小功能结构单位,是基因工程抗体研究领域中的热点,具有比单克隆抗体在生物病原体、微生物污染和寄生虫病等预防、检测和治疗的独特优点和应用前景。鉴于其重要性,单链抗体在不同的表达系统中得到表达与研究。简要综述了scFv的表达。

单链抗体及其在肿瘤免疫上的应用

随着分子生物学的进一步发展,抗体技术也逐步由细胞工程抗体向基因工程抗体演替,特别是单链抗体(ScFv)在理论和应用方面的研究令人尤为关注。ScFv应用范围的不断扩大和研究的不断深入,它在肿瘤的研究中也发挥了越来越大的作用。现综述ScFv的构建、表达及其在肿瘤免疫诊断和免疫治疗中的研究应用。

抗肿瘤坏死因子-α单链抗体在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化

目的构建抗肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)单链抗体(Single chain fragment variable,scFv)的原核高效表达体系,并优化表达条件。方法在引物中添加编码6×His的核苷酸片段,使目的蛋白C-末端带有6×His标签。从质粒pCANTAB 5E-scFv中PCR扩增scFv基因,连接至pBV220载体,连接产物分别转化至E.coli BL21(DE3)和DH5α中,42℃诱导表达,并对诱导时间、培养基pH值和类型进行优化,Western blot分析表达产物的反应原性。结果 PCR扩增出的scFv基因片段长度约770 bp,且序列正确;重组表达质粒pBV220-scFv经酶切鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中可获得表达,在E.coli DH5α中不表达;表达的重组scFv相对分子质量约为28 000,以包涵体形式存在于胞浆中,表达量约占菌体总蛋白的15%,且可与抗His-Tag抗体发生特异性反应;工程菌的最佳诱导表达条件为:以E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在pH 7.4的LB培养基中,42℃诱导5 h。结论将scFv的表达载体更换为pBV220,可提高scFv的表达量,在优化表达条件下,scFv的表达水平进一步提高。

TNF-α单抗Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌的表达

目的进行ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ段基因的克隆并在大肠杆菌中表达。方法用逆转录－聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆重链Ｆｄ段和κ链基因；并用ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析证明表达的Ｆａｂ段特异结合ＴＮＦ－α。结果从分泌抗人ＴＮＦ－α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆出了重链Ｆｄ段和κ基因。经ＤＮＡ序列测定表明，ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ３Ｄ、ＤＳＰ２和ＪＨ４；Ｖκ和Ｊκ分别属于Ｖκ１和Ｊκ１。将该Ｆｄ和κ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ中，在大肠杆菌中获得了表达。结论ＥＬＩＳＡ和免疫印迹分析表明，表达的Ｆａｂ段可特异地和ＴＮＦ－α结合。