传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗对鳜肠道微生物的影响研究

为探究接种传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗对鳜肠道微生物的组成结构及相关功能基因的影响,对体质量(20±1.8) g的鳜进行腹腔注射传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗,对照组注射等体积无菌生理盐水。对照组和免疫组放入用纱网隔开的同一池塘中养殖,28 d后每组各采集10尾肠道粪便样本,用高通量测序,构建文库。高通量测序共获得9669条序列,平均长度为543 bp。Alpha多样性分析结果显示,Chao1指数在对照组中更高,香农指数和辛普森指数在免疫组中更高,表明免疫后肠道微生物的多样性和丰度增加。在门水平上,对照组肠道微生物以变形菌门为优势菌门,相对丰度为72.23%;免疫组以变形菌门和衣原体门为优势菌门,相对丰度分别为28.57%和11.13%。在属水平上,对照组以气单胞菌属为主要优势属,相对丰度高达71.73%;免疫组以衣原体属和埃希氏杆菌属为主要优势属,相对丰度分别为11.57%和8.7%。免疫组与对照组相比,共筛选到9656个差异丰度基因,其中有840个基因高丰度,8816个基因低丰度。差异基因主要富集在双组分系统、ABC转运子、嘌呤代谢、群体感应、细菌趋药性、鞭毛组装和细菌分泌系统等通路,通路中的绝大部分基因的丰度在免疫组中均降低。上述结果表明,传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗免疫后鳜肠道微生物的组成和功能基因变化明显,可引起致病菌维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌比例的减少,同时引起乳酸菌属、芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属等有益细菌比例增加,这可为了解疫苗的作用机制提供新思路。

鳜暴发流行病病毒性病原研究

患病鳜肾脏、脾脏、肝脏、心脏、鳃中发现二十面体病毒粒子，肾脏和脾脏是其感染主要器官．成熟病毒粒子直径１５０ｎｍ，核心球状，直径１０５ｎｍ．受感染细胞肿大，直径为正常细胞３～４倍，细胞核萎缩，为正常细胞核直径１／３．病毒粒子部分纯化后，经腹腔人工感染，第７天开始死亡，１０ｄ内死亡率为１００％，表现与池塘养殖状态相同症状，并在人工感染鳜肾和脾中电镜观察发现大量相同病毒粒子，命名为传染性脾肾坏死病毒（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｓｐｌｅｅｎａｎｄｋｉｄｎｅｙｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＩＳＫＮＶ）．

基于荧光定量PCR的鳜传染性脾肾坏死病毒滴度检测方法

针对传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的ORF007基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立了ISKNV的实时荧光定量PCR方法。采用CPE法对连续10倍稀释的ISKNV培养液的滴度进行了测定,同时采用荧光定量PCR法测定病毒拷贝数。结果显示,荧光定量PCR测定的病毒拷贝数与CPE法测定的病毒滴度具有良好的线性关系,其线性方程为y=1.076x+0.545(R2=0.998 6),其中y为基因组拷贝数浓度的对数,x为病毒滴度TCID50的对数。研究表明,荧光定量PCR法可替代CPE法应用于ISKNV疫苗抗原的定量,大大缩短了疫苗制备的时间,为疫苗生产提供了方便。

鳜传染性脾肾坏死病毒的纯化和酶切分析

鳜传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）是近年来危害广东地区鳜养殖业的主要病原。本文用回接感染健康鳜获得病毒原料，分离纯化了大量高纯度的ＩＳＫＮＶ病毒粒子，电镜下可见病毒粒子为二十面体，直径平均为１５０ｎｍ。抽提病毒核酸，对其基因组ＤＮＡ进行酶切分析，病毒基因组为双链ＤＮＡ分子，表现脊椎动物虹彩病毒基因组的特点即其胞嘧啶５’端高度甲基化。以限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ和ＰｓｔＩ酶切ＩＳＫＮＶ基因组ＤＮＡ，经电泳分离后，分别得到１、８、９、１８、２２条清晰的酶切片段，并根据酶切片段算得基因组的大小超过１０８．７ｋｂｐ。

鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的胞嘧啶5-甲基转移酶基因结构及其序列分析

对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒 (infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)的胞嘧啶 5 -甲基转移酶(MTase)基因的结构及序列进行了分析。序列比较分析表明 ,ISKNVMTase编码区全长 6 84bp ,编码长 2 2 7个氨基酸的蛋白质 ,推测分子量为 2 5 85 5D。与一些细菌的MTase比较 ,ISKNVMTase也含有负责转移甲基的 4个保守区 ,但缺乏识别靶序列的保守区。比较ISKNV与其它 6种脊椎动物虹彩病毒的MTase序列并建立系统树 ,ISKNV显著不同于蛙病毒属和淋巴囊肿病毒属。 7种脊椎动物虹彩病毒MTase具有高度保守区 ,可以此设计引物用PCR方法鉴定脊椎动物虹彩病毒。

同步接毒条件下鳜传染性脾肾坏死病毒在CPB细胞中的最适增殖条件

为了获知鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)同步接毒最适增殖条件,通过检测不同血清浓度、病毒接种量、细胞状态等培养条件下的病毒拷贝数,确定鳜脑组织细胞(CPB)同步接种ISKNV的最适体外增殖条件。结果表明,上述各因素对ISKNV的增殖量均有明显影响。其中选取处于对数生长中期的CPB细胞,胰酶消化后按照病毒感染复数(MOI)为0.2同步接种ISKNV,培养液中胎牛血清终浓度为6%时,28℃恒温培养9 d后收获,所得病毒拷贝数最多,为2.54×108拷贝/m L。将所测得病毒拷贝数折算成培养基成本进一步分析表明,按照上述相同条件进行接毒,每元人民币培养基所得病毒量也最高,为4.24×1011拷贝。综上所述,本研究基于病毒增殖量及培养基成本对病毒增殖条件进行优化,可为低成本ISKNV疫苗的生产提供理论依据。

鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为Ig G1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1∶51 200和1∶400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1∶200、Western Blotting的使用浓度为1∶1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白,为建立ISKNV疫苗抗原含量检测方法奠定了基础。

鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。

鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证

将大肠杆菌重组表达的鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)主衣壳蛋白(MCP),以不同剂量(20μg/尾、50μg/尾、100μg/尾)腹腔注射免疫幼鳜(2月龄),测定各免疫组的血清抗体效价变化规律、头肾淋巴细胞增殖刺激指数(SI)、肝脏Mx蛋白表达及相对免疫保护率(RPS)。结果表明,各免疫组抗体效价在第14天时达到峰值,其中50μg/尾免疫组的抗体效价最高,随后各组的效价均下降,至第35天时与对照组无差异;头肾淋巴细胞经LPS、ConA刺激后,50μg/尾免疫组及100μg/尾免疫组的刺激指数均升高,其中50μg/尾免疫组的刺激指数最高,20μg/尾免疫组与对照组无差异;在免疫后48h各剂量免疫组Mx蛋白均有低量表达,对照组无表达,各免疫组表达量无显著差异;免疫后第36天攻毒,50μg/尾免疫组的相对保护率最高,为64.3%。研究结果表明,重组MCP蛋白有较好的免疫原性,可以激发鳜特异性免疫及非特异性免疫应答,当免疫剂量为50μg/尾时,免疫保护效果最好。

鳜亲环蛋白A在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用

为研究鳜亲环蛋白(CypA)在传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)感染中的作用,通过RT-PCR克隆了CypA全长开放读码框(SC-CypA)。结果表明SC-CypA基因全长495 bp,编码164个氨基酸,分子量为17.59 ku。通过Blast比对和同源性进化分析,发现其与人、鼠、原鸡和斑点鲖等物种的CypA具有高度相似性,表明SC-CypA属于CypA家族的成员。环孢素A(CsA)具有免疫抑制作用,是CypA的抑制剂。结果发现,CsA浓度与ISKNV增殖具有一定的剂量依赖关系;CsA作用不同时间对ISKNV均有抑制效果;CsA对ISKNV感染诱导的细胞因子的表达具有调节作用,能抑制IL-1β、IL-8、IL-18和ISG15的表达。研究表明,宿主的CypA对ISKNV的增殖起着重要的作用,通过添加其抑制剂CsA能有效抑制病毒的增殖。

巢式PCR检测鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)

鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)是鳜暴发性传染病的主要病原,给鳜养殖业造成了严重的经济损失,因此快速、灵敏的检测方法对鳜养殖业的发展具有非常重要的意义。根据鳜ISKNV主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计了2对引物,利用巢式PCR方法对病鱼脾肾组织进行扩增,建立了ISKNV快速特异的巢式PCR检测方法。应用该方法对含MCP基因的质粒进行倍比稀释后检测扩增的灵敏度可达到5fg;巢式PCR检测的灵敏度是一步法PCR的104倍以上。

鳜弹状病毒与传染性脾肾坏死病毒双重PCR检测方法的建立

【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。

鳜鱼传染性脾肾坏死病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的方法,本研究根据GenBank中ISKNV MCP基因的保守序列设计并合成1对引物和1条TaqMan探针,建立了该病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.994,具有良好的线性关系,检测下限为20拷贝/μL,是常规PCR的1 000倍;特异性强,只有ISKNV呈阳性,而与流行性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒和草鱼呼肠孤病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间的变异系数均小于0.7%。本研究建立的ISKNV TaqMan荧光定量PCR方法对ISKNV的快速检测及定量检测具有重要意义。

传染性脾肾坏死病毒、ConA和LPS对体外鳜的头肾淋巴细胞转化的影响

采用 ＷＴＴ颜色反应法研究传染性脾肾坏死病毒（ＩＳＫＮＶ）、伴刀豆球蛋白 Ａ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｌｉｎ Ａ，ＣｏｎＡ）和脂多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）在离体状态下对健康和ＩＳＫＮＶ感染后存活３０ｄ或６０ｄ的鳜的头肾淋巴细胞转化的影响。结果表明，ＣｏｎＡ和ＬＰＳ能促进健康级头肾淋巴细胞的转化，而对感染后存活３０ｄ或６０ｄ的鳜头肾淋巴细胞没有作用；纯化的ＩＳＫＮＶ对健康鳜头肾淋巴细胞没有促进淋巴细胞转化的作用，但对ＣｏｎＡ的作用有抑制，对感染后存活的３０ｄ或６０ｄ的鳜头肾淋巴细胞，纯化的ＩＳＫＮＶ有一定的促进转化的作用。感染存活的鳜头肾中有对ＩＳＫＮＶ的免疫记忆性Ｔ细胞。另外，用建立的ＩＳＫＮＶ ＰＣＲ检测方法对健康和ＩＳＫＮＶ感染后存活的鳜组织进行了检测，结果显示，健康鳜为阴性，而ＩＳＫＮＶ感染后存活的鱼，头肾、后肾、脾脏和部分鱼的心脏为阳性。ＩＳＷ在鳜体内形成潜伏感染。

传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时检测传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鳜鱼蛙病毒(Siniperca chuatsi ranairidovirus,SCRIV)和鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)的三重PCR检测方法,为鳜鱼等养殖品种流行病学调查提供方法支撑。【方法】根据ISKNV MCP基因、SCRIV MCP基因和SCRV N基因设计3对特异性引物,对PCR扩增反应中的退火温度和引物用量进行优化,建立可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV的三重PCR方法。为验证该方法的敏感性和特异性(备测病毒为IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV和SVCV),对22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的样品分别进行单一和三重PCR检测。【结果】成功建立了三重PCR检测方法,利用该方法可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV,特异性较好,对IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV、SVCV等无扩增;该方法敏感性好,对3种病毒核酸的检测下限均为0.01 ng/μL;利用该方法和3种病毒单一PCR方法同时对22份临床样品进行检测,结果显示2种方法吻合率为100%,其中ISKNV阳性率为27%、SCRIV阳性率为41%、SCRV阳性率为9%、ISKNV和SCRIV混合感染阳性率均为9%,无ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染。【结论】建立的三重PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点,可对这3种病毒进行快速鉴别诊断。

鳜鱼传染性脾肾坏死病和弹状病毒病二联灭活疫苗毒种及种子批的研究

【目的】建立鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和弹状病毒(SCRV)二联灭活疫苗毒种库及种子批。【方法】以ISKNV-QY0910株和SCRV-GM1503株为原始毒种,扩繁10代(F1~F10)后检测各代病毒对鳜鱼脑组织细胞系(CPB)的致病性及其滴度,并检测其对鳜鱼的毒力。PCR扩增ISKNV的主衣壳蛋白(MCP)基因、RT-PCR法扩增SCRV G蛋白基因序列,检测ISKNV和SCRV毒种的特异性。对F1、F5和F10代ISKNV、SCRV毒种进行细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒(RANA)和神经坏死病毒(NNV)检测,检验毒种的纯粹性。分别将F1、F5和F10代ISKNV、SCRV病毒液用甲醛灭活后制备灭活疫苗,免疫鳜鱼21 d后攻毒,连续观察14 d,待鱼体稳定后统计死亡率并计算免疫保护率(RPS)。将ISKNV和SCRV毒种湿毒保存于-80℃冰箱,每6个月取3支检测病毒滴度,以确定毒种的保存期。【结果】各代次毒株感染CPB细胞后产生的CPE形态及病变速度基本相同,SCRV滴度为10^(8.58)~10^(8.875) TCID_(50)/mL,ISKNV滴度为10^(7.38)~10^(7.625) TCID_(50)/mL。F1、F5和F10代ISKNV按10^(4) TCID_(50)/mL、SCRV按10^(6.5) TCID_(50)/mL对鳜鱼攻毒(每尾0.1 mL),致死率均超过90%。ISKNV和SCRV各代次毒种可分别扩增出1300 bp的MCP基因和1500 bp的G基因,特异性良好。ISKNV、SCRV毒种无细菌、霉菌、支原体及鳜鱼蛙病毒和神经坏死病毒污染。各代次病毒灭活疫苗对鳜鱼安全有效,免疫保护率ISKNV可达92%以上,SCRV可达84%以上;湿毒-80℃保存,保存期为36个月。【结论】10代以内ISKNV和SCRV的生物学特性稳定,可用于鳜鱼ISKNV和SCRV二联灭活疫苗的制备与检验。

鳜AKT2在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用

【目的】研究鳜AKT2(ScAKT2)在传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)增殖中的作用,为鳜ISKNV防控提供参考。【方法】克隆ScAKT2基因开放阅读框,构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化。用纯化后的ScAKT2重组蛋白免疫日本大耳兔后制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体的效价,用间接免疫荧光和Western blot法测定抗体的特异性。克隆鳜AKT2基因,构建过表达载体pCMV-EGFP-ScAKT2,将其转染至CPB细胞系中构建ScAKT2过表达细胞系,用荧光显微镜检测转染效率,用qRT-PCR法及Western blot法分别测定ScAKT2 mRNA水平和蛋白水平的表达,以鉴定ScAKT2过表达细胞系是否构建成功。将ISKNV接种至ScAKT2过表达细胞系中,用qPCR法及Western blot法分别测定ISKNV病毒拷贝数及ISKNV-MCP蛋白的表达,用qRT-PCR法测定ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA水平的表达情况。【结果】PCR扩增获得1400 bp的AKT2 ORF片段,成功构建了原核表达质粒,诱导表达出72 ku的重组蛋白。成功制备了ScAKT2多克隆抗体,抗体效价达1∶256000,纯化后质量浓度约为10 mg/mL。成功构建了pCMV-EGFP-ScAKT2过表达载体和过表达ScAKT2的CPB细胞系,过表达ScAKT2 CPB细胞可极显著抑制ISKNV的增殖,能明显上调ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA的表达水平。【结论】ScAKT2通过上调先天免疫因子的表达抑制ISKNV的增殖,为鳜ISKNV防控提供了新的潜在靶点。

DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼传染性脾肾坏死病毒

以ISKNV MCP基因为目的基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建成DNA疫苗pcMCP,对鳜鱼(Siniperca chuatsi)pcMCP DNA疫苗进行浸泡免疫效果研究。结果表明,pcMCP DNA疫苗能够刺激免疫系统,对非特异性免疫和Ig M的表达都具有激活作用。免疫后血液中白细胞含量、白细胞吞噬能力和SOD活力都显著提高,14 d时均达到最大。IgM和Mx基因的mRNA表达研究显示,72 h大量表达,96 h达到最大,分别是对照组的3.05倍和2.02倍。攻毒试验显示,浸泡免疫能够有效保护ISKNV感染的鳜鱼,在第11天,浸泡免疫组的累计死亡率仅为40%,而对照组死亡率都达到了100%,pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鳜鱼死亡率。

鳜传染性脾肾坏死病毒研究进展

自1994年以来,鳜传染性脾肾坏死病毒病每年给我国鳜养殖业造成数亿元的经济损失,严重制约着鳜鱼养殖业的发展,目前已被列为国际兽医局(International Epizootic Office,OIE)申报疫病。其病原传染性脾肾坏死病毒因广泛的宿主范围和极高的致死率,越来越得到研究者的关注。本综述对近年来有关传染性脾肾坏死病毒的病原特性、功能基因、检测方法和疫苗研制等研究进行概述、归纳与简评,旨在为鳜传染性脾肾坏死病毒研究提供借鉴。