秦岭特色药用植物桃儿七内生真菌代谢产物的分离鉴定及生物活性研究

以秦岭无病害健康桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌为研究对象,采用萃取法从菌丝中分离活性代谢产物,并对其结构进行鉴定,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测了代谢产物的细胞毒活性,采用Ellman光度法检测了代谢产物的乙酰胆碱酯酶抑制活性,并检测了代谢产物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。结果表明,在桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌代谢产物中分离并鉴定了10个萜类化合物,其中化合物1-1、1-2、1-3和1-4为新化合物。化合物1-3、1-4和1-8对A549、HeLa和HepG2细胞均表现出明显的细胞毒活性;化合物1-3对乙酰胆碱酯酶表现出较强的抑制活性;化合物1-1、1-2、1-3和1-4对α-葡萄糖苷酶均未表现出明显的抑制活性。表明,基于桃儿七内生烟色拟盘多毛孢菌分离出具有抗肿瘤活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性的萜类化合物,为桃儿七内生真菌用于抗肿瘤及治疗阿尔兹海默病新药开发提供了新思路。

遮光对桃儿七植株生长的影响

目的:探索适宜桃儿七人工栽培的最佳遮光条件。方法:以一、二、三年生桃儿七植株为试验材料,设置30%、50%、70%遮光处理,以不遮光为对照。结果:一年生桃儿七植株移栽成活率为30%~40%,二年生桃儿七植株移栽成活率为50%~70%,三年生桃儿七植株移栽成活率为70%~90%;综合株高、株幅、茎基部粗、根长、根粗、须根数、根鲜重、折干率等农艺性状的结果表明,6至8月是桃儿七植株根部快速生长期,30%和50%遮光率有利于桃儿七植株根部的营养生长。遮光处理的单根鲜重增加量均大于对照,增加量由大到小为50%遮光率>30%遮光率>70%遮光率>CK;桃儿七根折干率随生长时间的延长,整体呈下降-上升-下降的趋势。结论:30%~50%遮光能够提高桃儿七植株移栽成活率,且有利于其生长,建议桃儿七人工栽培时可选择此遮光率,并于植株地上部分枯萎前进行采收。

野生桃儿七引种繁育与栽培技术研究

桃儿七既有美丽的外观可以用来观赏,又有显著的医学作用,应用于药物研发中,当然后者比前者的潜力更大,只是桃儿七的原生状况并不理想,野生种群的数量在持续下降,在气候变暖的背景下以及自然繁殖这两个因素的影响下,即使桃儿七的生存能力再强,也会因为被野鹿吃掉大部分果实、鸟类啄食桃儿七的幼芽影响桃儿七的成长以及产量。而桃儿七的人工种植在其原生地并不难,可以在秋季采种,选择在当年的秋季与次年春天播种,实现当年种植当年收获。桃儿七作为中国特有物种,在抗癌方面有显著的贡献,希望在经过引种繁育之后对人类的健康做出更多的贡献。

桃儿七茎叶组织内生真菌多样性

通过用两种传统培养基(PDA、SDA)分离方法对5个自然野生分布的桃儿七群落(分布于青海省、甘肃省和四川省)茎叶组织内的内生真菌多样性进行研究,并用形态学与分子生物学的方法鉴定菌株。实验结果显示,720个茎叶组织块中共分离到141株内生真菌。依据真菌在培养基上的形态初步划分为52个分类单元,经鉴定归属于19属,其中茎组织中16属>叶组织中6属,桃儿七茎叶组织中的真菌优势属为拟青霉属,相对分离频率为26.34%。5个采样点间内生真菌的香浓维纳多样性指数为0.71—1.41,Sorenson相似性系数为0.13—0.50,定殖率为14.58%—28.47%。通过对PDA、SDA两种培养基以及茎、叶组织的定殖率进行统计,结果显示:PDA(17.50%)<SDA(21.67%),茎(29.72%)>叶(9.44%)。研究结果表明,桃儿七茎叶组织中内生真菌的多样性较低,不同采样点间宿主植物内内生真菌群落的相似性较低,真菌群落结构存在差异。研究为进一步扩大从桃儿七中筛选产鬼臼毒素等活性物质内生真菌提供了一种新的思路。

桃儿七传粉生物学特性及其在进化上的意义

对分布于云南中甸县不同居群的桃儿七进行了传粉生物学特性研究，结果如下：①首次发现其具有一种适应于自花授粉的传粉机制。即在花尚未开放或刚开放时，雌蕊呈直立状，而一旦花完全开放时，子房柄会发生弯曲，以致整个雌蕊靠向某一花药，从而使柱头与花药贴合实现传粉；当完成传粉后，雌蕊又重新直立，此时受精作用也随之完成。整个传粉、受精过程仅需4～6h。②其生殖节律快，有效率高。从孢子母细胞减数分裂开始到双受精结束只需4～6d。自然居群中结果率几乎达100％，结籽率达97．32％。③桃儿七是一个种内分化强烈、在表型及生态适应上均表现出多样性的物种，具有较大的当前适合度。

基于模糊物元模型的桃儿七潜在地理分布研究

桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying)为小檗科多年生草本植物,是我国传统濒危藏药。依据模糊物元模型建立桃儿七分布点位以及其产量数据与12个气候环境因子之间的模糊隶属函数,采用最大信息熵模型确定评价指标权重,利用GIS空间分析功能确定我国西部7省桃儿七生境适宜性空间分布。研究表明研究区桃儿七不适宜生境面积占研究区总面积的61.76%;低适宜生境占20.11%;中适宜生境占7.70%;高适宜生境占10.43%,主要集中在青藏高原东缘的四川、甘肃、青海境内次生植被丰富、地形复杂的高海拔地区。结果显示基于GIS与模糊物元构建的生境适宜性评价模型可以准确的对我国西部7省桃儿七生境适宜性做出科学综合评价,量化适宜生境面积和空间分布,为其资源保护和管理提供科学依据。

HPLC法测定青海栽培与野生桃儿七中2种木脂素类的含量

采用超声法和HPLC法提取和测定青海栽培桃儿七植株中不同部位鬼臼毒素和4'-去甲基鬼臼毒素的含量,并与野生桃儿七药材进行比较。结果表明,青海栽培和野生桃儿七植株内鬼臼毒素的含量分布均表现为:根>叶柄>叶,栽培桃儿七的叶柄和叶中鬼臼毒素含量均大于野生桃儿七;青海栽培桃儿七植株内4'-去甲基鬼臼毒素含量表现为:叶柄>根,叶中未检测到此物质;野生植株内4'-去甲基鬼臼毒素的含量分布表现为:侧根>叶柄>根状茎>叶,果实中未检到此物质,栽培桃儿七叶柄中4'-去甲基鬼臼毒素的含量大于野生桃儿七。

濒危药用植物桃儿七的离体培养研究

以桃儿七种子诱导的无菌苗为材料,研究了外源激素对芽诱导、增殖和生根的影响,建立了桃儿七离体培养再生体系。结果表明:芽诱导阶段,采用3.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1GA3激素组合,出芽率最高可达85.71%,缩短出芽时间30～40 d,在添加3.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IAA的MS培养基上利于增殖,增殖速度快,增殖系数1.63。以WPM+1.5 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-1NAA的培养基培养30 d后,生根率可达60.1%。

小叶莲化学成分的研究

目的研究小叶莲Sinopodo-phyllum hexandrum(Royle)Ying的化学成分。方法小叶莲95%乙醇提取物采用硅胶柱、Sephadex LH-20、ODS柱进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离得到10个化合物,分别鉴定为5-羟基麦芽酚(1)、对羟基苯甲酸(2)、香草酸(3)、2,4,6-三羟基苯甲酸乙酯(4)、对羟基苯甲酸乙酯(5)、原儿茶酸(6)、β-谷甾醇(7)、胡萝卜苷(8)、5-羟甲基糠醛(9)、α-棕榈酸甘油酯(10)。结论化合物1、2、4、5为首次从该属植物中分离得到,化合物6、9、10为首次从该植物中分离得到。

桃儿七HPLC指纹图谱研究

目的:建立不同生长地桃儿七HPLC指纹图谱测定方法。方法:筛选适当提取方法,采用Diamonsil C18色谱柱,0.04%甲酸水-乙腈梯度洗脱,流速0.5 mL/min,检测波长290 nm,柱温30℃条件下,记录液相色图谱。结果:建立了含19个峰的桃儿七的HPLC指纹图谱,并进行相似度比较;鬼臼毒素为内参比物,计算了指纹图谱中共有峰的相对含量。结论:该方法准确、快速、简便,可用于桃儿七的真伪鉴别和质量控制。

西藏八角莲与桃儿七根及根茎SSH文库的建立

以西藏八角莲(Dysosma tsayuensis Ying)和桃儿七[Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying]为材料,构建其根及根茎的SSH文库,从中筛选鬼臼类植物属种间与鬼臼毒素生物合成相关的差异表达基因。从文库中随机挑取201个阳性克隆测序后得到183条ESTs。去除载体序列和冗余序列,聚类拼接得到17个西藏八角莲的unique ESTs。经BLAST同源比较和功能查寻,有功能注释的unique ESTs共12个,占70.6%,所编码的蛋白涉及光合作用、合成代谢、转录调控等功能;无功能注释和匹配结果的共5个,占29.4%。该研究成功构建了西藏八角莲和桃儿七SSH文库,为进一步揭示鬼臼毒素生物合成途径及其调控机制奠定了基础。

濒危藏药桃儿七根生物反应器生产鬼臼毒素的研究

目的:建立桃儿七根生物反应器技术体系,通过植物激素和生物诱导子处理提高鬼臼毒素生产能力。方法:以桃儿七种胚为外植体,研究不同激素组合对愈伤不定根诱导的影响;分离桃儿七内生真菌,研究其发酵产物以及茉莉酸甲酯、冠菌素对不定根鬼臼毒素积累的影响;高效液相色谱法测定鬼臼毒素含量。结果:吲哚乙酸、玉米素、表油菜素内酯分别与毒莠啶、2,4-二氯苯氧基乙酸、独脚金内酯三种组合都能够高效的诱导向不定根方向发育的胚性愈伤组织,在低浓度吲哚乙酸和萘乙酸存在的条件下,40 d左右根长达到(5±1)cm;粉红粘帚霉发酵液、茉莉酸甲酯、冠菌素都能显著的促进不定根鬼臼毒素的积累。结论:通过细胞工程和发酵工程相结合的手段成功建立了桃儿七不定根生物反应器生产鬼臼毒素的体系,为工业化大规模生产奠定了基础。

药用植物桃儿七的研究进展

对近几年来桃儿七生物学特性、化学成分、药理作用、细胞培养和人工种植等方面的研究进展进行综述,并提出了资源保护和可持续利用的建议,为桃儿七的综合开发奠定了基础。

高效液相色谱法测定桃儿七中槲皮素及山柰酚

目的测定桃儿七中槲皮素及山柰酚的量。方法采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18柱（4.0 mm×250 mm,5.0μm）;甲醇-0.1%磷酸溶液（50∶50）为流动相,体积流量1.0 m L/min;检测波长360 nm。结果槲皮素、山柰酚分别在0.037 2-0.744μg和0.019 4-0.388μg范围内具有良好线性关系,平均回收率分别为97.8%（RSD为1.1%）和98.6%（RSD为1.4%）结论该法准确、灵敏,可用于桃儿七中槲皮素及山柰酚的定量测定。

甘肃野生桃儿七人工驯化技术研究

通过全株移栽、种子繁殖和分根繁殖等栽培试验,初步总结了甘肃省野生桃儿七的适宜栽培技术要点,为甘肃今后开展人工栽培桃儿七奠定了良好的基础。

不同氮与磷配比施用对桃儿七产量的影响

通过对中药材桃儿七在定植前施用不同氮与磷配比组合的肥料试验,探讨了施肥对桃儿七产量的影响。结果表明,施用氮(N)75～225kg/hm2、磷(P2O5)150～225kg/hm2,可获得较高的桃儿七产量,增产幅度比不施肥料的提高1倍以上;氮(N)与磷(P2O5)的配比在1∶1～1∶2,则桃儿七在田间的长势较好,增产效果明显,从投入产出比的角度来看也比较科学合理。建议在目前人工栽培桃儿七的大田管理水平前提下,采用氮(N)与磷(P2O5)的配比在1∶1～1∶2,于桃儿七定植前施入,可获得较佳的经济收益。

基于ISSR分子标记的野生桃儿七遗传多样性研究

通过对甘肃南部青藏高原边缘区道地性药材桃儿七遗传多样性研究,为野生桃儿七资源的保护提供依据。采用ISSR分子标记技术,对13个野生桃儿七居群153份DNA进行PCR扩增,对其扩增条带进行遗传多样性分析,在所得遗传距离的基础上进行UPGMA聚类和Mantel检验地理距离,对野生桃儿七居群间遗传多样性差异进行分析。11条ISSR引物共检测到155个条带,每条引物10～17个,平均14.1个,共1320个多态性位点;居群平均多态性位点百分比(PPL)65.50%;Nei′s遗传多样性指数(H)为0.2101,Shannon′s信息指数(I)为0.3191;遗传距离变化范围0.0316～0.3769;Mantel检验P=0.4220。甘肃南部青藏高原边缘区13个野生桃儿七居群间具有较高的遗传多样性,种群内的基因流十分丰富,居群内的遗传分化明显比居群之间的分化要大,各居群间遗传距离与地理距离无相关关系。

藏药澳毛赛原植物的生药鉴定

目的:对藏药澳毛赛原植物桃儿七的果实和根进行生药学鉴定,为其鉴别及应用提供科学依据。方法:对原植物进行形态描述,根及根茎和果实进行性状鉴定、横切片和粉末显微观察,描述所见结果。结果:藏药澳毛赛在原植物形态、显微特征上有明显的鉴别特征。结论:通过原植物、性状、显微特征能够很好地鉴别藏药澳毛赛。

桃儿七质量标准的研究

目的建立桃儿七Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying的质量标准。方法分类学方法鉴别桃儿七基源性状,显微鉴别和薄层色谱法(TLC)鉴别桃儿七基源,测定杂质、水分、总灰分、酸不溶性灰分、重金属及有害元素、农药残留、醇溶性浸出物含量,HPLC法测定4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、鬼臼毒素含量。结果桃儿七显微鉴别与薄层鉴别特征显著。初步拟定桃儿七中杂质不得超过4.00%,水分不得超过9.00%,总灰分含量不得超过4.00%,酸不溶性灰分含量不得超过1.00%,铅含量不得超过5 mg/kg,镉含量不得超过1 mg/kg,砷含量不得超过2 mg/kg,汞含量不得超过0.2 mg/kg,铜含量不得过20 mg/kg,马拉硫磷、杀螟硫磷、抗蚜威、溴氰菊酯、甲氰菊酯含量均不得超过0.01 mg/kg,醇溶性浸出物含量不得少于5.00%,鬼臼毒素含量不得少于2.80 mg/g。结论该方法简便,专属性强,重复性好,可有效控制桃儿七的质量。