罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)Sip基因的克隆、鉴定及分子特性分析

利用设计的特异性引物,扩增出了分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株Sip基因,并将其克隆到pMD19-T载体上,之后对重组质粒进行了PCR和双酶切(BamHⅠ+HindⅢ)鉴定,并利用多种生物信息学软件对Sip基因进行分子特性分析。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌Sip编码氨基酸序列具有极高保守性,与人源、哺乳动物源无乳链球菌亲缘性达100%,存在1个由25个氨基酸组成的信号肽,具有1个与免疫调节功能相关的LysM结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点33个和N-糖基化位点2个,编码多肽链中疏水区大于亲水区,是一种膜外蛋白。密码子偏爱性分析表明,罗非鱼源无乳链球菌Sip基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性与真核生物较为接近。

Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表达及杀虫活性分析

苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringicnsis(Bt)是一种广泛存在于自然界中的生防微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的内毒素(insecticidal crystal proteins,ICPs)、营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,VIP)和分泌期杀虫蛋白(secreted insecticidal protein,Sip),相比于以上2种杀虫蛋白,Sip的研究相对较少。本研究从实验室中的Bt野生菌株中克隆sip基因,其中编号为DQ89的Bt菌株成功克隆得到1188 bp大小的sip基因,编码395个氨基酸,与已知的Sip1A蛋白的相似性为87%,序列提交到Gen Bank并获得登录号KP114614。将该基因在大肠杆菌中表达的蛋白进行生物活性测定,结果显示其对大猿叶甲Colaphellus bowringi Baly具有一定的杀虫活性,其LC50为1.542μg/m L。

奶牛无乳链球菌内蒙古分离株SIP基因的克隆与序列分析

试验根据GenBank公布的牛源无乳链球菌SIP基因序列设计并合成1对引物,通过PCR扩增获得SIP基因部分扩增产物。序列分析结果表明:SIP基因扩增产物大小为945 bp,编码315个氨基酸残基。标准菌株(+株)与内蒙古分离株(M株)的基因及氨基酸同源性为100%,这2个菌株与Gen-Bank上公布的B群无乳链球菌菌株(DQ914274)SIP基因及氨基酸同源性达到98.94%及99.68%。

Ⅰa型牛源无乳链球菌M7菌株Sip基因的分子特征分析

通过PCR方法扩增Ⅰa型牛源无乳链球菌地方菌株M7的Sip基因,将目的片段克隆入pGEM-T Easy载体并进行测序,采用多种生物软件对Sip基因及其表达的蛋白质进行分子特征分析。试验结果表明,M7菌株的Sip基因为1305bp,未出现基因缺失;与GenBank中发表的不同血清型的无乳链球菌菌株的相应核苷酸序列同源性为98.0%～100.0%,推导的氨基酸同源性为97.2%～99.8%。M7的Sip基因与中国菌株Ly2(FJ808732)和美国菌株GB00549(FJ752159)的相应基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性均为100.0%,氨基酸同源性均为99.8%。该Sip基因表达的蛋白质是一种稳定的分泌性外膜蛋白,疏水性强;其N-末端的第52-95位氨基酸残基之间含有1个LysM超家族的保守结构域;存在1-25位氨基酸的信号肽,剪切位点在第25-26位氨基酸之间;存在多个B细胞和T细胞表位。说明M7菌株的Sip基因是未缺失LysM超家族结构域的比较保守的免疫蛋白。

CacyBP/SIP基因siRNA的筛选

目的探讨靶向钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)基因的3对小干扰RNAs(small interference RNA,siRNAs)转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,能否抑制CacyBP/SIP基因的表达。方法化学合成3对CacyBP/SIP特异性siRNA(CacyBP/SIP-siRNA),分别转染MDA-MB-231细胞,RT-PCR法、Western blotting方法分别检测转染前后MDA-MB-231细胞的CacyBP/SIPmRNA和蛋白的水平。结果 CacyBP/SIP-siRNA001成功转染入人乳腺癌MDA-MB-231细胞,RT-PCR结果显示,siRNA001组CacyBP/SIP mRNA的表达量为NC-siRNA阴性对照组的(25.2±1.34)%,siRNA002和siRNA003则为(64.8±0.58)%和(77.5±1.27)%,CacyBP/SIP-siRNA001转染后能够抑制MDA-MB-231细胞中CacyBP/SIPmRNA,沉默效率为(74.8±0.75)%(P<0.05),Western blotting证实了siRNA001的沉默作用。结论 CacyBP/SIP-siRNA001能显著沉默MDA-MB-231细胞中CacyBP/SIP mRNA和蛋白的表达。

无乳链球菌Sip基因的克隆与原核表达

无乳链球菌表面免疫相关蛋白(Surface immunogenic proteins,Sip)具有高度保守性,是无乳链球菌疫苗研究的重要靶标。通过PCR技术扩增Sip基因,将其插入pET-22b载体构建重组质粒pET-22b-Sip,并对重组质粒进行双酶切、PCR鉴定及测序;转入BL21(DE3)中诱导表达,检测重组蛋白的大小及反应原性。结果表明,所扩增Sip基因大小为1 300bp,与GeneBank参考序列同源性为99.16%;蛋白分析表明,目的蛋白大小为50KDa,具有良好的反应原性,为无乳链球菌的免疫预防提供依据和基础。

CacyBP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的观察干扰小RNA(siRNA)介导的Cacy BP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响。方法化学合成Cacy BP/SIP基因序列特异性siRNA(Cacy BP/SIP siRNA),采用脂质体法转染siRNA至MDA-MB-231细胞(Cacy BP/SIP siRNA组),MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Realtime PCR和Western blotting检测MDA-MB-231细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白的表达。另设阴性对照组和空白对照组。结果与阴性对照组和空白对照组比较,Cacy BP/SIP siRNA组MDA-MB-231细胞增殖能力显著下降(P<0.05),细胞凋亡率显著增高(P<0.05)。Caspase-3和Bax mRNA及蛋白表达上调(P<0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白表达下调(P<0.05)。结论靶向沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中Cacy BP/SIP基因表达后,可以抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡,其作用可能通过下调Bcl-2表达,上调Caspase-3和Bax表达发挥诱导细胞凋亡的作用。

Ⅰa型和Ⅱ型牛源无乳链球菌sip基因的遗传进化分析

为分析8株Ⅰa型和10株Ⅱ型牛源无乳链球菌的sip基因特征和遗传进化关系,采用PCR方法扩增目的基因并克隆入pGEM-T Easy载体后测序,进行了同源性分析和构建了遗传进化树。结果显示,18株菌株的sip基因全长均为1 305bp,无基因缺失。8株Ⅰa型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为99.8%～100%和99.5%～100%;而10株Ⅱ型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性均为100%。18株菌株与其他不同来源、不同血清型参考菌株相应序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为97.8%～100%和96.8%～99.8%。sip基因的遗传进化树分析显示18株菌株处于2个不同的大分支上,其中Ⅱ型菌株处于同一分支上,与中国菌株Mf32和美国菌株GB01068、GB01089的亲缘关系最近,而Ⅰa型菌株处于另一个分支上,与中国菌株Ly2和美国菌株GB00549的亲缘关系最近。说明8株Ⅰa型菌株和10株Ⅱ型菌株分别来源于不同的菌株,但它们的sip基因同源性很高,而且与参考菌株的sip基因相比,目前仍属于保守基因。

牛乳腺炎无乳链球菌内蒙古分离株sip基因抗原表位序列的高效表达及其抗原性鉴定

目的本实验的目标是克隆、高效表达牛源无乳链球菌的sip基因抗原优势区序列,并进行其抗原性鉴定。方法根据GenBank中已公布的牛源无乳链球菌sip基因序列抗原表位序列设计1对引物,以无乳链球菌分离菌株基因组DNA为模板,PCR扩增sip抗原表位序列,并进行克隆、测序、转化、表达及抗原性鉴定。结果克隆的sip基因抗原表位序列为897 bp,编码299个氨基酸,与GenBank中公布的牛无乳链球菌sip基因(AF151361)比对后,其相似性为99.8%,氨基酸相似性为99.7%;经高效表达后其可溶性表达率48.7%。重组蛋白的分子质量单位为40.3 ku。经纯化得到纯度在90%以上的SIP蛋白,Western blot显示重组蛋白能被抗无乳链球菌血清识别。结论本研究成功构建了rSIP-pET30(a)重组质粒,并高效表达SIP,且该重组蛋白具有抗原性,为建立奶牛隐性乳腺炎抗体监测方法与乳中无乳链球菌的检测方法奠定了基础。

Bt新型基因sip的克隆、表达和生物信息学分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白对农业害虫有特异的杀虫活性,对环境无污染、对人畜无害,成为目前为止研究和应用最为广泛的生物杀虫剂。其中内毒素(insecticidal crystal proteins,ICPS)和营养期杀虫蛋白(vegetativeinsecticidal protein,VIP)研究范围广、技术成熟,而分泌期杀虫蛋白(Secreted insecticidal protein,Sip)相关报道较少。为进一步发掘我国苏云金芽胞杆菌的菌株资源和新型基因资源,从不同生态环境中分离出400株Bt野生菌株进行Sip基因的克隆鉴定,其中Bt野生菌株QZL26扩增得到1 038 bp的碱基的序列,编码345个氨基酸,与Sip1A蛋白氨基酸序列同源性为91.83%。测序结果提交GenBank注册,登录号为JQ965994。

牛源无乳链球菌sip蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

为测定牛源无乳链球菌表面免疫相关蛋白(sip)的抗原性,本实验通过建立间接ELISA方法,对该蛋白的抗原性进行分析及鉴定。根据无乳链球菌sip基因序列,设计一对引物,以临床分离菌株基因组DNA为模板,PCR扩增sip抗原表位优势区编码的基因序列,并将其与原核表达载体pET-30a(+)连接,构建重组质粒pET-sip,转化宿主菌BL21中,经IPTG诱导,获得重组蛋白,western blot分析表明,重组蛋白具有良好的抗原性。以纯化的表达产物作为包被抗原,建立检测无乳链球菌抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.125μg/mL,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶4 000。应用该方法对无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌兔阳性血清进行检测,结果表明,该方法具有良好的特异性和灵敏度。

奶牛乳房炎无乳链球菌Fc-Sip和金黄色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗的免疫试验研究

为探究由IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌(S.agalactiae,Sgc)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sau)保护性抗原亚单位疫苗的免疫效果,在本实验室前期研究基础上,本研究按体积11的比例将Sgc的Fc-Sip和Sau的Fc-FnBPB-ClfA两种蛋白分别与1%的盐酸左旋咪唑(1%LH)充分混合,制备两种亚单位疫苗。将即将干奶(妊娠220 d)、CMT试验为"++"以上的奶牛随机分为4组,分别将Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗(A组)、Fc-Sip亚单位疫苗(B组)、Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗(C组)通过首次肌肉免疫和二次乳头管灌注免疫方式进行免疫试验。通过免疫前后对乳样细菌分离、体细胞数测定及免疫血清抗体滴度测定,评价上述亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛的乳样细菌分离率分别为80%、90%、80%,其中Sgc检出率分别为20%、30%、10%,Sau检出率分别为30%、20%、10%;首免90 d后3个免疫组奶牛乳样细菌分离率分别降至20%、20%、40%,其中Sgc的检出率分别降至0、0、10%,Sau的检出率分别降至10%、10%、0,对照组免疫前后以上各项检测无明显变化。使用利拉伐牛奶体细胞检测仪检测免疫前后试验奶牛乳样中的体细胞数,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛体细胞数均值分别为6.19×105个/mL、5.16×105个/mL、5.49×105个/mL,首免90 d后3个免疫组奶牛乳样中体细胞数均值分别为2.05×105个/mL、2.04×105个/mL、2.52×105个/mL,而对照组奶牛乳样体细胞数与免疫前无明显变化。检测首免后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d的血清抗体滴度,结果显示,首免后7 d,免疫组(A、B、C)80%的奶牛血清抗体滴度为11024;第14 d后,免疫组(A、B、C)90%奶牛血清抗体滴度达到12048;第28 d后,免疫组(A、B、C)80%奶牛血清抗体滴度在14096~18192,比对照组平均上升3~4个抗体滴度,对照组奶牛血清抗体滴度一直保持在1256~1512。综合分析以上试验结果显示免疫A组(Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA)综合免疫效果在各免疫组中最佳。本研究结果表明Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎具有较好的治疗和预防作用,为奶牛隐形乳房炎的防治提供了实验依据。

IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌保护性抗原Sip亚单位疫苗的研究

为研究无乳链球菌Fc-Sip亚单位疫苗的免疫效果,并验证IgGFcRn在奶牛乳腺发生局部免疫过程中的重要作用。本研究采用大肠杆菌原核表达系统,表达了由IgGFcRn介导无乳链球菌保护性表面抗原蛋白(Sip)的融合蛋白Fc-Sip,并与佐剂混合制成Fc-Sip亚单位疫苗。选取干奶前15 d的奶牛进行加州乳房炎检测法(CMT)检测,选取120头CMT(++)以上的奶牛进行分组免疫。通过免疫前后的细菌分离试验、牛奶体细胞数测定、免疫牛血清抗体间接ELISA检测来评价该亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前乳样细菌分菌率为86.6%,无乳链球菌检出率为46.6%;免疫后乳样分菌率降至40%,无乳链球菌检出率降至13.3%,表明Fc-Sip亚单位疫苗不但可以治疗无乳链球菌性奶牛乳房炎,还可以抑制其它奶牛乳房炎致病菌的侵入。首次免疫后60 d,免疫组80%奶牛血清抗体滴度达到1∶2 048～1∶4 096,对照组奶牛抗体滴度一直保持在1∶512。首次免疫后90 d,使用利拉伐牛奶体细胞计数仪测定实验奶牛乳样中的体细胞数,免疫组奶牛乳样体细胞数范围在0.17×10~5个/mL～3.91×10~5个/mL,对照组奶牛乳样体细胞数的范围在4.05×10~5个/mL～7.27×10~5个/mL。免疫组奶牛血清抗体滴度的升高及免疫后牛奶中体细胞数的减少,表明该亚单位疫苗促进了奶牛体液免疫反应和局部免疫反应的发生,也证明该亚单位疫苗具有降低牛奶体细胞数的作用。本研究为奶牛乳房炎无乳链球菌疫苗的研制奠定了基础。

奶牛乳腺炎无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因主要抗原区域的融合表达及抗原性鉴定

为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk及纤连蛋白FbsA三重活性的多亚单位融合蛋白,研究其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性,根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因的核苷酸序列,利用DNAStar软件对蛋白的抗原表位序列进行分析并设计合成包括重叠PCR引物共4对引物,通过重叠PCR技术将前2个基因主要抗原区域进行拼接后插入pET30a(+)载体,再将第3个基因插入。为减少三重基因串联表达过程中3个蛋白之间空间构象的干扰,在3个基因连接处各引入1段45bp的柔性linker,结果重组基因在BL21感受态中实现了可溶性表达,表达的蛋白约62 000;Western blot试验表明多亚单位融合蛋白可被无乳链球菌多抗识别,且由此融合蛋白制备小鼠多抗能够识别sip、pgk及FbsA等3个蛋白;这表明构建的多亚单位融合蛋白可能具备sip、pgk及FbsA蛋白的三重活性,而且在小鼠的攻毒保护性试验中,重组多亚单位融合抗原对攻毒小鼠的保护优于单个蛋白。本试验为牛无乳链球菌性乳腺炎新型疫苗的研究提供了一定的参考数据。

双重PCR检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

根据罗非鱼源无乳链球菌16SrRNA基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1 305bp和121bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16SrRNA基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05×102 CFU;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。

无乳链球菌及其血清型的PCR方法鉴定

无乳链球菌(S.agalactiae)是引起奶牛乳房炎和新生儿期侵袭性感染(包括败血症、肺炎和脑膜炎)的重要病原菌。为快速准确地鉴定S.agalactiae及其血清型,本研究对22株从国内不同地区分离的牛源链球菌进行生化鉴定以及针对S.agalactiae保守基因sip进行PCR鉴定,并采用多重PCR技术扩增sip基因阳性菌株的cps基因进行血清分型。结果显示,PCR扩增sip基因阳性17株,其中15株生化试验与PCR结果一致;多重PCR扩增cps基因显示,其中Ia型4株、Ⅱ型11株、Ⅲ型2株。本研究为鉴定S.agalactiae及其血清型提供了参考。

奶牛乳腺炎无乳链球菌sip与pgk双基因主要抗原区域的融合表达

为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk双重活性的融合蛋白,探讨其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性。根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk基因的核苷酸序列,设计合成4条引物,通过重叠PCR技术将2个基因主要抗原区域进行融合表达;在2个基因连接处引入45bp连接肽的核苷酸序列;重组蛋白通过pET30a(+)载体及BL21表达菌实现原核表达,表达的蛋白大小约为47 000;Western blot检测表明,重组蛋白可被无乳链球菌多抗识别,具有较好地免疫生物学活性。本研究为奶牛乳腺炎无乳链球菌亚单位疫苗的研发提供了一定的理论依据。

SIP1基因编码区点突变及多态性在先天性巨结肠症中的检测与分析

目的检测先天性巨结肠症（Hirschspnmg disease, HSCR）患者 SIP1 （Smad-interacting protein 1 ）基因编码区点突变及单核苷酸多态性特点，探讨SIP1基因与HSCR的关系。方法应用聚合酶链反应一单链构像多态性（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP） 和DNA直接测序技术，对50例HSCR、30名正常对照外周血SIPI基因编码区的10个外显子，进行点突变与单核苷酸多态性的检测与分析。结果HSCR与正常对照突变图谱比较，有1例病例在第7外显子出现杂合性缺失，密码子157位点GTG→GTA置换，引起亮氨酸的同义突变，属于单核苷酸多态性，突变率为2％（1／50）。有4例患者在第8外显子出现突变，突变率为8％（4／50）。PCR-SSCP银染分析，第2外显子2例出现相同类型泳动变位；第7外显子3例出现相同类型泳动变位；第8外显子7例出现相同类型泳动变位。结论HSCR有SIPI基因突变，提示SIPI基因与HSCR的发病存在一定程度的关联。

SIP1基因在先天性巨结肠症中的表达研究

目的 研究SIP1 （smad-interacting protein 1）基因在先天性巨结肠症（Hirschsprung Disease,HD）中的表达情况,探讨SIP1与HD发病的关系.方法 利用荧光实时定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）、蛋白印迹（Western blot）和免疫组化方法检测30例HD狭窄段（无神经节细胞）和正常段（神经节细胞）肠管组织患儿SIP1的表达,并对其表达进行定量与比较分析.结果 SIP1在HD狭窄段肠管中mRNA表达为19.19±0.23,均高于正常段肠管中的表达11.06±1.12,差异有统计学意义（P＜0.05）.Western Blot结果显示,SIP1在HD狭窄段肠管中蛋白相对含量为53.73±0.49,明显高于正常段肠管蛋白含量18.32±1.54,差异有统计学意义（P＜0.05）.免疫组化结果显示,SIP1在HD狭窄段肠管中高表达,呈棕黄色；正常段肠管低表达,无色或淡黄色.结论 SIP1 mRNA与蛋白在HD狭窄段肠管中高表达,提示SIP1与HD的发生有密切关系,可能在先天性消化道畸形的肠道发育中具有重要作用.

环境微生物群落功能研究的新方法和新策略

微生物群落在驱动生物地球化学循环中扮演着重要角色,传统的研究方法可对微生物群落进行遗传结构的解析,但不能有效地与功能研究耦联。概述了近年发展起来的基于核酸和蛋白质水平的分子生物学新方法——环境mRNA和rRNA同时荧光原位杂交(FISH)、寡核苷酸微阵列技术(Oligonucleotide Microarray)、稳定性同位素联合宏基因组学(SIP-enabled Metagenomics)和环境蛋白质组学(Metaproteomics)在环境微生物群落功能研究中的应用,并且对其发展趋势进行了分析和展望。