活骨灌注液对激素诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化及Sirt1/LC3基因表达的影响

目的探讨活骨灌注液对激素诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化及Sirt1/LC3基因表达的影响。方法将SD大鼠骨髓腔提取的骨髓间充质干细胞(BMSCs)随机分为对照组、激素组和中药组。对照组给予基础培养基或成骨诱导培养基,激素组在对照组基础上给予10-5 mol/mL地塞米松,中药组在激素组基础上给予10^(-4) v/v活骨灌注液。MTT法检测细胞活力,qRT-PCR检测成骨分化关键基因RunX2、ALP和Ocn表达,茜素红染色检测钙化,Western blot和免疫荧光检测Sirt1和LC3蛋白表达情况。结果与对照组相比,激素组细胞活力,RunX2、ALP和Ocn mRNA表达,钙化结节数量和Sirt1、LC3-Ⅱ蛋白表达均降低,Sirt1核转移减少,自噬被抑制(P<0.05);与激素组比较,中药组细胞活力,RunX2、ALP和Ocn mRNA表达,钙化结节数量和Sirt1、LC3-Ⅱ蛋白表达均增加,Sirt1核转移增强,自噬被激活(P<0.05)。结论活骨灌注液可促进Sirt1核转移和LC3蛋白介导自噬泡形成使细胞自噬水平增加,拮抗地塞米松对BMSCs活力及成骨分化和钙化的抑制作用。

五味子酚上调SIRT1改善H_2O_2对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用研究

目的:探讨SIRT1/LC3自噬通路在五味子酚(Schisanhenol,Sal)抗H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞增殖活力下降中的作用。方法:加入不同浓度Sal(50、10μmol/L)处理SH-SY5Y细胞4 h后,再加入H_2O_2 100μmol/L处理12 h,采用MTT法检测细胞增殖能力,Western blot检测SIRT1蛋白和自噬蛋白标志物(LC3蛋白、Beclin-1蛋白)的表达水平。结果:H_2O_2组细胞增殖活力较对照组显著下降(P<0.001);Sal组不同浓度(50、10μmol/L)干预后的细胞增殖活力均高于H_2O_2组(P=0.001、0.017),且随着Sal浓度增加,细胞增殖活力增强。H_2O_2组SIRT1蛋白含量较对照组明显降低(P<0.001),Sal组不同浓度(50、10μmol/L)的SIRT1蛋白含量均明显高于H_2O_2组(P=0.001、0.014)。H_2O_2组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达均高于对照组,比较差异均有统计学意义(P<0.001);Sal组(50μmol/L)的Beclin-1的蛋白表达低于H_2O_2组,且不同浓度(50、10μmol/L)LC3-Ⅱ蛋白表达均低于H_2O_2组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Sal可通过上调SIRT1蛋白表达,拮抗H_2O_2引起的过度自噬,从而起到拮抗H_2O_2对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用。

耳聋左慈丸对H_(2)O_(2)损伤小鼠耳蜗基底膜miR-34a的作用及机制

目的探讨耳聋左慈丸对H_(2)O_(2)致小鼠耳蜗基底膜损伤模型miR-34a的作用及其机制。方法采用C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜的离体培养,实验分为对照组、H_(2)O_(2)模型组(0.3 mmol·L^(-1))、耳聋左慈丸组(5 mg·L^(-1)、10 mg·L^(-1)和50 mg·L^(-1))。q-RTPCR检测miR-34a表达,免疫荧光法检测沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)、微管相关轻链蛋白3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和选择性自噬接头蛋白(p62/sequestosome 1,SQSTM1)在耳蜗基底膜毛细胞的表达;TUNEL法检测基底膜毛细胞的凋亡情况。结果与对照组相比,模型组小鼠耳蜗基底膜miR-34a表达明显升高(P<0.01),耳聋左慈丸组miR-34a表达下降(P<0.01);模型组小鼠耳蜗基底膜毛细胞SIRT1蛋白表达与对照组相比明显降低(P<0.01),LC3-Ⅱ和p62蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01),TUNEL阳性细胞数增多;与模型组比较,耳聋左慈丸组SIRT1表达升高(P<0.05),LC3-Ⅱ和p62蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05),TUNEL阳性细胞数减少。结论耳聋左慈丸可能通过作用于miR-34a,调节SIRT1蛋白,进而影响耳蜗毛细胞的自噬和凋亡,达到抑制H_(2)O_(2)致毛细胞氧化损伤的作用。

川芎嗪通过AMPK/SIRT1通路介导的自噬在急性肝衰竭中的作用及其机制研究

目的 探讨川芎嗪对脂多糖(LPS)/D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导的急性肝衰竭小鼠的作用及其机制。方法 将C57BL/6J小鼠随机分对照组、模型组、川芎嗪组、川芎嗪联合SIRT1抑制剂(EX527)组,每组10只。通过ip LPS/D-GalN构建急性肝衰竭小鼠模型,检测血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平;苏木精–伊红(HE)染色检测肝组织病理学变化;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肝组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β和环氧化酶-2(COX-2)mRNA水平;检测肝组织中氧化应激因子谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量;Western blotting检测肝组织中沉默调节蛋白1(SIRT1)、磷酸化单磷酸腺苷活化蛋白激酶α(p-AMPK)α/AMPKα蛋白和自噬相关蛋白人微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/LC3-I、p62的水平。结果 与模型组比较,川芎嗪组小鼠血清ALT和AST水平均显著降低,肝细胞坏死区域以及炎症细胞浸润明显减少,肝组织中MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β、COX-2 mRNA和p62蛋白水平均显著降低,SOD、GSH、SIRT1、p-AMPKα/AMPKα、LC3-II/LC3-I蛋白水平显著升高(P<0.05)。EX527处理后显著逆转了川芎嗪对急性肝衰竭小鼠的作用。结论 川芎嗪通过抑制LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭小鼠炎症反应发挥肝脏保护作用,其机制可能与AMPK/SIRT1信号通路和自噬有关。

白藜芦醇对血清剥夺诱导大鼠皮层神经元自噬的影响

目的:研究白藜芦醇(RSV)对血清剥夺诱导大鼠神经元自噬的影响及分子机制。方法:将原代培养的大鼠皮层神经元分为对照组(control)、血清剥夺组(SD)、RSV处理组(RSV)和RSV联合组SIRT1抑制剂EX527处理组(RSV+EX 527),利用乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞活性,免疫荧光染色检测沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)的表达变化、Western Blot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达水平变化。结果:与正常对照组相比,血清剥夺引起细胞活性下降、SIRT1表达下降,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例减少,Beclin1表达降低(P <0. 05);经过RSV处理后,细胞活性增加(P <0. 05),大鼠神经元SIRT1表达增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增加,Beclin1表达增加;使用EX 527处理后,RSV的神经保护作用受到抑制。结论:RSV通过激活SIRT1活性促进大鼠皮层神经元自噬。