沉默调节蛋白3通过mTOR信号途径调节溶酶体功能抑制U87细胞凋亡

目的探讨沉默调节蛋白3(sirtuin 3,Sirt3)在胶质瘤细胞U87中的作用,为胶质瘤的早期诊治提供新靶点。方法基于中国脑胶质瘤数据库(CGGA)、GEPIA2数据库,通过生物信息学分析Sirt3在胶质瘤不同分级的表达情况,通过Western blot检测6位胶质瘤患者癌旁与肿瘤组织中Sirt3的蛋白水平。利用shRNA慢病毒、CRISPR/Cas9系统干预U87细胞Sirt3的表达,采用TUNEL染色、PI-Annexin V双荧光标记检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase3及LAMP1、LAMP2、LAMP2A、TFEB、mTOR等蛋白的表达。利用mTOR小分子抑制剂Rapamycin处理Sirt3敲减U87细胞,检测相关蛋白及细胞凋亡的变化。对Sirt3敲除前后的U87细胞进行核质分离实验,并检测p-TFEB蛋白表达的变化。在敲减及敲除Sirt3的U87细胞中分别过表达TFEB及Sirt3后,检测溶酶体膜蛋白表达的变化情况。结果Sirt3在高级别胶质瘤中高表达,且与患者的低生存率密切相关。敲减Sirt3表达后细胞凋亡增加(P<0.01),溶酶体膜蛋白LAMP1、LAMP2、LAMP2A显著下调(P<0.01),p-mTOR显著增加(P<0.01),通过核质分离实验发现敲除Sirt3后p-TFEB在胞质中增加(P<0.01)。在Sirt3敲除组过表达Sirt3后,LAMP1、LAMP2蛋白水平恢复,且溶酶体数量显著增加(P<0.01);在Sirt3敲减组过表达TFEB后,LAMPs蛋白表达明显上调(P<0.01)。结论Sirt3可能通过调控mTOR信号通路影响TFEB的核质分布,上调溶酶体膜蛋白LAMPs表达增强胶质瘤细胞溶酶体功能,进而促进胶质瘤细胞存活和恶性增殖,提示Sirt3可能是胶质瘤临床诊断和进展的分子标志物。

黄芪甲苷通过激活Sirt3抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大及氧化应激

目的研究Sirt3在黄芪甲苷抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大和氧化应激中的作用。方法α-actinin染色检测心肌细胞大小;MitoSOX染色检测ROS;Real time PCR检测心肌肥大标记物ANP、BNP和β-MHC的mRNA水平;Western blot法检测心肌细胞肥大信号通路蛋白水平。结果100nmol·L-1血管紧张素Ⅱ处理心肌细胞48 h,心肌细胞面积与ANP、BNP、β-MHC mRNA水平显著增加,ROS水平及NOX-2、NOX-4表达显著增加,Sirt3表达显著降低;黄芪甲苷预处理心肌细胞1 h显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导的上述效应。Sirt3-siRNA干预Sirt3蛋白水平,显著抑制黄芪甲苷的心肌肥厚抑制作用以及抗氧化作用,上调ROS水平,促进心肌肥大。结论黄芪甲苷通过激活Sirt3抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大以及氧化应激。

和厚朴酚通过激活线粒体依赖的Sirt3/AMPK途径减轻脂多糖所致的急性呼吸窘迫综合征

目的:探讨和厚朴酚(honokiol,HKL)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所致的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)肺微血管内皮细胞的作用及潜在机制。方法:动物实验中,40只C57BL/6J小鼠随机分为对照组(Con组)、LPS干预组(LPS组)、LPS+HKL干预组(HKL组)、LPS+HKL+尼克酰胺(nicotinamide,NAM)干预组(NAM组),每组10只。细胞实验中,实验分为对照组(Con组)、LPS干预组(LPS组)、LPS+HKL干预组(HKL组)、LPS+HKL+NAM干预组(NAM组)和LPS+HKL+混合抑制剂(compound C,CMC)干预组(CMC组)。采用HE染色观察肺组织病理改变;检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白浓度、细胞总数、中性粒细胞数及肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性;伊文思蓝实验检测肺微血管渗透性的改变;采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测HKL对人肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMECs)活力的影响;采用抑制剂NAM和CMC干预探讨HKL保护性作用的分子机制;采用Western印迹检测组织或细胞Sirt3,caspase-3,cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax,p-腺苷酸活化蛋白激酶(p-adenosine monophosphate activated protein kinase,p-AMPK)和AMPK蛋白表达。结果:动物实验中,与Con组比较,LPS组小鼠肺组织呈典型的ARDS病理改变,肺组织湿干重比(W/D)值及MPO活性、BALF蛋白浓度、细胞总数和中性粒细胞数、伊文思蓝渗漏指数(evans blue leaking index,ELI)和肺组织cleaved caspase-3表达均显著升高(均P<0.05),而Sirt3表达明显下调(P<0.05);与LPS组比较,HKL组的上述改变显著改善(均P<0.05);与HKL组比较,NAM组中HKL干预的疗效可部分抑制(均P<0.05)。细胞实验中,与LPS组比较,HKL组HPMECs的存活率升高(P<0.05),Bcl-2和Sirt3蛋白表达显著上调(均P<0.05), Bax和cleaved caspase-3蛋白表达下调(均P<0.05),AMPK通路活化加强(P<0.05);与HKL组比较,CMC组HKL干预的疗效被部分抑制(均P<0.05)。结论:HKL能够显著减轻LPS所致的ARDS,抑制肺微血管内皮凋亡,其作用可能是通过线粒体依赖的Sirt3/AMPK途径实现的。

苓桂术甘汤对心梗后慢性心衰大鼠线粒体分裂-融合及Sirt3/AMPK信号通路的影响

目的:探讨苓桂术甘汤对心肌梗死(MI)后慢性心力衰竭(CHF)大鼠线粒体分裂-融合及沉默信息调节因子3(Sirt3)/单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响。方法:SD大鼠随机分为假手术组(生理盐水,仅穿线不结扎)、模型组(生理盐水,结扎冠状动脉左前降支近心端)、苓桂术甘汤组(4.2 g·kg^(-1))、卡托普利组(0.00257 g·kg^(-1)),每组10只,连续给药28 d。彩色多普勒超声成像仪检测大鼠心功能参数变化;苏木素-伊红(HE)染色观察心脏病理学改变;免疫荧光法检测活性氧(ROS)水平;JC-1法检测线粒体膜电位;比色法检测三磷酸腺苷(ATP)水平、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、线粒体呼吸链复合物活性(Ⅰ~Ⅳ);原位末端标记法(TUNEL)染色检测心肌组织细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Sirt3、磷酸化(p)-AMPK、磷酸化动力相关蛋白1(p-Drp1)、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、线粒体分裂因子(MFF)、视神经萎缩蛋白1(OPA1)蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)显著升高(P<0.01),左室短轴缩短率(LVFS)、左室射血分数(LVEF)显著降低(P<0.01);心肌组织出现炎性细胞浸润,病理损伤明显,ROS、MDA水平与心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.01),SOD水平、ATP含量、膜电位显著降低(P<0.01);线粒体呼吸链复合物活性(Ⅰ~Ⅳ)显著降低(P<0.01);p-Drp1、Fis1、MFF蛋白水平显著上调(P<0.01),Sirt3、p-AMPK、OPA1蛋白水平显著下调(P<0.01)。与模型组比较,苓桂术甘汤组与卡托普利组LVIDd和LVIDs显著降低(P<0.01),LVEF和LVFS显著升高(P<0.01),心肌组织炎性细胞浸润与病理损伤明显减轻,ROS、MDA水平与心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.01),SOD水平、ATP含量、膜电位显著升高(P<0.01);线粒体呼吸链复合物活性(Ⅰ~Ⅳ)显著升高(P<0.01);p-Drp1、Fis1、MFF蛋白表达显著下调(P<0.01),Sirt3、p-AMPK、OPA1蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论:苓桂术甘汤可缓解心肌细胞氧化应激与细胞凋亡损伤,改善线粒体功能,其作用可能与线粒体分裂-融合、Sirt3/AMPK信号通路有关。

氢离子对视网膜氧化应激损伤的保护作用机制研究

目的探讨氢离子对氧化应激诱导的视网膜损伤的保护机制。方法 C57BL/6J雄性小鼠30只,随机分为对照组、模型组和治疗组,其中治疗组给予氢离子水灌胃7 d、模型组给予蒸馏水灌胃7 d后均建立视网膜损伤动物模型,对照组仅用蒸馏水灌胃,之后按前述方法分别持续灌胃5 d后处死,HE染色观察视网膜形态;二氢乙啶染色观察视网膜中活性氧的含量;剥离视网膜,Western blot检测氧化应激标志性蛋白ogg1、Sirt3及衰老相关蛋白P53、P21和P16的表达。结果视网膜HE染色结果显示,治疗组视网膜黑色玻璃膜疣沉积与模型组相比少且小;治疗组中氧化应激标志性蛋白ogg1相对表达量(0.63±0.04)明显低于模型组(0.96±0.02),差异具有统计学意义(P<0.05),与对照组(0.42±0.05)相比差异无统计学意义(P>0.05)。二氢乙啶染色结果表明,治疗组的视网膜的活性氧含量较模型组低;治疗组中Sirt3蛋白相对表达量(1.02±0.05)较模型组(0.55±0.04)显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗组中衰老相关蛋白P53、P21、P16的相对表达量(0.53±0.05、0.40±0.01、0.71±0.01)较模型组(1.06±0.04、0.70±0.03、1.29±0.05)均显著降低,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。结论氢离子通过减少Sirt3表达的下调和抑制衰老对氧化应激诱导的视网膜损伤起保护作用。