人Sirt6基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的:对人Sirt6基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法:从Gene Bank数据库中获取人Sirt6基因5’调控区,使用在线软件JASPAR对该序列可能存在的转录因子结合位点进行预测。结果:Relative profile score threshold在85%、90%、95%和100%时,该序列存在939、276、70和9个可能的转录因子结合位点,包含Ahr、SPIB、Pdx1、Prrx2、MZF1、Mafb和KLF5等。结论:人Sirt6基因5’调控区存在多种转录因子的结合位点,这些转录因子大多与免疫系统调节、肿瘤发生和代谢调节等有关。

水牛SIRT6基因shRNA干扰慢病毒载体构建与验证

本研究旨在构建SIRT6基因的RNA干扰慢病毒载体,并在水牛成纤维细胞中验证载体的有效性。设计合成2条特异性水牛SIRT6基因的shRNA序列,分别将其克隆至Psi-LVRU6GP慢病毒干扰载体上,重组质粒通过琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定。将重组质粒与慢病毒包装载体NRF、VSVG共转染293T细胞,荧光显微镜下检查转染效果。转染60 h后收集病毒悬液,并感染水牛胎儿成纤维细胞(BFF),qRT-PCR检测干扰效果。结果显示:成功构建了2个RNA干扰SIRT6基因表达的慢病毒重组质粒;经慢病毒包装感染水牛成纤维细胞后检测SIRT6 mRNA表达水平,干扰载体Psi-sh1-LVRU6GP、Psi-sh2-LVRU6GP均能有效下调SIRT6的表达,与质粒对照组相比差异显著,Psi-sh2-LVRU6GP的干扰效果最好。SIRT6基因shRNA干扰慢病毒载体的成功构建为研究SIRT6基因对水牛细胞衰老的影响及其机制奠定基础。

脂肪组织特异性Sirt6基因敲除小鼠发生非酒精性脂肪肝

为了探讨脂肪组织特异性Sirt6基因敲除对小鼠肝脏的影响,利用CrE-LoxP系统获得脂肪组织特异性Sirt6基因敲除小鼠的基础上,通过组织病理学检查,Sirt6基因敲除小鼠和野生型小鼠的肝脏组织形态,进而提取两种基因型小鼠的肝脏组织RNA,通过实时定量PCR分析肝脏中参与脂肪生成的关键基因以及炎症标记物的表达水平。结果显示,成功获得脂肪组织特异性Sirt6基因敲除小鼠,组织病理学检查表明,无论是正常饮食还是高脂饮食,Sirt6基因敲除后小鼠均会发生脂肪肝并伴有炎症反应;此外,实时定量PCR的分析结果也显示,肝脏组织中参与脂肪生成的关键基因以及炎症标记物的表达均有明显升高。表明脂肪组织特异性Sirt6基因敲除小鼠发生非酒精性脂肪肝。

人SIRT6蛋白的原核表达及纯化

目的:构建带GST标签的人源沉默信息调节因子6(SIRT6)基因原核表达载体并表达纯化GST-SIRT6重组蛋白。方法:以人乳腺文库为模板,经PCR扩增,酶切后插入带GST标签的pGEX-KG载体,连接成GST-SIRT6重组质粒进行测序;GST-SIRT6重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态,并加入IPTG进行小量诱导,通过Western印迹检测GST-SIRT6蛋白表达;将能成功诱导GST-SIRT6表达的菌液大量扩增,IPTG诱导后利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化GST-SIRT6蛋白,并用考马斯亮蓝染色检测;运用GST Pulldown实验验证SIRT6和缺氧诱导因子HIF1α的相互作用。结果:从乳腺文库中,PCR扩增出约1059 bp的SIRT6基因;诱导GST-SIRT6重组蛋白表达并纯化获得纯度较好的重组蛋白;GST-Pulldown实验检测出有相互作用条带。结论:构建了GST-SIRT6原核表达载体,验证了GSTSIRT6与HIF1α的相互作用,为进一步研究SIRT6在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。