沉默信息调节因子6(sirtuin6)在糖尿病肾病中的作用机制

sirtuins(SIRT)隶属于NAD(+)-依赖性脱乙酰酶家族的一种,归于组蛋白脱乙酰酶家族,它的七种酶活性(SIRT1-SIRT7)能够影响细胞内的代谢过程,而近几年最新的研究表明,sirt6能够抑制糖尿病肾病患者肾脏的代谢,从而改善肾病的病情,这一发现受到越来越多的重视。sirt6能够显著改善足细胞、系膜细胞、内皮细胞和管壁细胞的功能,它能够抑制炎症反应、促进细胞内的自我修复和减轻肾脏细胞凋亡,为糖尿病患者提供了一种有效的防治措施,以减缓肾功能的恶化。尽管SIRT6在控制糖尿病肾病方面的作用已经有所了解,但仍有许多有待进一步探索的空间,以便能够获得有效的治疗方案,从而为更有效地延缓糖尿病肾病提供理论依据。

Sirt6通过调控P53/SLC7A11/GPX4通路抑制骨骼肌细胞铁死亡

目的:探讨骨骼肌细胞铁死亡的发生及sirtuin 6 (Sirt6)对其调控的分子机制。方法:将C2C12小鼠成肌细胞分为对照组、erastin(Era;铁死亡诱导剂)组、Era+ferrostatin-1(铁死亡拮抗剂)组、Era+MDL-800(Sirt6激动剂)组和Era+OSS-128167(Sirt6抑制剂)组;通过细胞活力和C2C12成肌细胞肌源性分化情况观察铁死亡诱导剂及拮抗剂的影响;RT-qPCR和Western blot测定成肌细胞及肌管中Sirt6、肌萎缩标志物、铁死亡标志物的mRNA及蛋白表达水平;进一步检测P53蛋白乙酰化水平、胞内亚铁离子(Fe2+)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)及脂质过氧化指标Liperfluo;免疫荧光法检测肌管分化标志物肌球蛋白重链(MHC)荧光信号。结果:Era降低成肌细胞活力和肌管分化质量,伴有Sirt6的mRNA和蛋白水平下降(P<0.05),肌萎缩标志物肌肉环指蛋白1(MuRF1)和肌萎缩F盒蛋白(MAFbx)表达增加(P<0.05)。激活Sirt6可抑制P53蛋白第381位赖氨酸乙酰化,降低P53表达水平,提高溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)水平,改善ROS、GSH、Fe2+和脂质过氧化等铁死亡特异性指标(P<0.05),逆转铁死亡导致的肌肉负性变化。反之,抑制Sirt6将进一步加重铁死亡。结论:Sirt6可抑制P53蛋白乙酰化使其活性降低,通过调控P53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制成肌细胞铁死亡,进而改善肌肉质量。

Sirt6与狼疮性肾炎足细胞损伤的关系

目的了解狼疮性肾炎(LN)病人肾组织去乙酰化酶沉默调节蛋白6(Sirt6)与足细胞损伤及疾病活动性的关系,以及LN病人足细胞损伤的潜在机制。方法选择初治且经肾穿刺活检证实为LN病人70例,根据系统性红斑狼疮(SLE)疾病活动度评分(SLEDAI评分)分为活动组47例(≥7分)、非活动组23例(<7分),另选15例因肾外伤行肾脏切除的病人作为对照组。收集全部病人的临床资料,采用光镜、电镜观察肾组织及足细胞的损伤情况,免疫组化方法检测病人足细胞肾病蛋白(Nephrin)及肾组织Sirt6的表达水平,并应用Spearman相关分析其与实验室检测指标的相关性。结果光镜观察显示,LN病人肾小球体积增大,系膜区增宽,系膜细胞及系膜基质增多,且活动组变化更明显。电镜观察显示,对照组肾小球足突完整、排列规则,基底膜连续;LN组肾小球系膜细胞、系膜基质明显增生,基底膜不均匀增厚,足突弥漫融合甚至消失,且活动组变化更明显。免疫组化染色显示,与对照组相比较,LN组足细胞Nephrin、肾组织Sirt6表达水平降低,且LN活动组较非活动组降低更明显。Spearman相关分析显示,肾组织Sirt6表达水平与24 h尿蛋白定量(r=-0.580,P<0.01)、红细胞沉降率(r=-0.559,P<0.01)、SLEDAI评分(r=-0.666,P<0.01)呈负相关,与补体C3(r=0.670,P<0.01)、血清清蛋白(r=0.660,P<0.01)、足细胞Nephrin表达(r=0.954,P<0.01)呈正相关。结论LN病人肾组织Sirt6表达降低可能与其足细胞损伤及疾病活动性有关。

人参皂苷Rg1在造血干/祖细胞连续移植中对延缓细胞衰老的作用与去乙酰化酶6/核因子-κB信号轴的关系

目的探讨人参皂苷Rg1在造血干/祖细胞(HSC/HPC)连续移植中对抗细胞衰老的作用与去乙酰化酶6/核因子-κB(SIRT6/NF-κB)信号轴的关系。方法免疫磁性分选法分离纯化雄性供体小鼠干细胞抗原阳性(Sca-1+)HSC/HPC,连续移植3代构建HSC/HPC衰老体内模型。60Coγ射线致死剂量辐射雌性受体鼠后分4组,照射对照组;衰老模型组;Rg1治疗衰老组;Rg1预防衰老组。造血祖细胞混合集落(CFU-Mix)培养,细胞周期分析和衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色分析Rg1体内调控Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。实时定量PCR及Western blotting检测衰老调控分子SIRT6、NF-κB mRNA及蛋白的表达。结果连续移植后受体鼠Sca-1+HSC/HPC出现细胞衰老特征,随移植代数的增加,Sca-1+HSC/HPC G0/G1期细胞比例及SA-β-Gal染色阳性率增高,CFU-Mix数量下降。与同代衰老模型组相比,Rg1治疗衰老组及Rg1预防衰老组受体鼠Sca-1+HSC/HPC G0/G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性率下降,CFU-Mix数量升高;SIRT6 mRNA及蛋白表达上调,NF-κB mRNA及蛋白表达下调;Rg1预防衰老组各指标变化均较Rg1治疗衰老组明显。结论 Rg1可能通过调控SIRT6/NF-κB信号轴发挥其对抗连续移植过程中Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对H9c2心肌细胞衰老影响

目的探讨矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)对H9c2细胞衰老的影响及其机制。方法应用D-gal构建H9c2心肌细胞衰老模型,并筛选出C3G最佳干预浓度。将正常H9c2心肌细胞分为正常对照组(应用PBS处理48 h)、D-gal处理组(应用10 g/L浓度D-gal处理48 h)、C3G处理组(应用1000μmol/L浓度C3G处理48 h)、C3G+D-gal组(应用1000μmol/L浓度C3G与10 g/L浓度D-gal共同处理48 h)。检测各组细胞增殖活性、细胞凋亡水平、细胞内活性氧(ROS)水平;应用SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒测定SA-β-gal表达,应用实时荧光定量PCR方法检测CD38、Sirtuin 6(Sirt6)、己糖激酶(HK2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)和端粒酶逆转录酶(TERT)的mRNA表达,WST-8方法检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的表达。结果使用10 g/L D-gal诱导H9c2心肌细胞48 h成功构建衰老心肌细胞模型,并筛选出C3G的最佳干预浓度为1000μmol/L。应用1000μmol/L浓度C3G进行干预,结果显示C3G可以抑制D-gal所诱导的衰老心肌细胞增殖水平降低(F=189.50,P<0.01)、凋亡水平升高(F=73.12,P<0.01)、细胞内ROS水平升高(F=106.00,P<0.01)以及SA-β-gal阳性细胞升高,降低D-gal诱导的衰老心肌细胞CD38、LDHA、HK2 mRNA表达(F=23.14~94.00,P<0.01),同时升高TERT、Sirt6 mRNA表达(F=43.24、86.81,P<0.01)及NAD+的水平(F=77.02,P<0.01)。结论C3G通过抑制CD38的表达和提高Sirt6的表达,干预心肌细胞凋亡和增殖及糖酵解酶的变化,影响ROS的产生,从而发挥减轻心肌细胞衰老损伤的作用。

沉默调节蛋白6-谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的克隆表达

目的构建含有人沉默调节蛋白6（hSIRT6）基因的重组原核表达载体，获得高效表达hSIRT6蛋白的基因工程菌，以及较高产量的SIRT6蛋白。方法取205ngHEK293细胞总RNA逆转录后合成的cDNA为模板，聚合酶链反应（PCR）扩增hSIRT6的编码序列，并克隆至原核表达载体pGEx-4T-3中，构建重组的质粒pGEX-4T-3／SIRT6；将重组质粒pGEX-4T-3／SIRT6转化感受态细菌BL21（DE3），在含100mg／L氨苄西林的LB平板37℃培养过夜，以pGEx-4T．3空载体作为对照，在相同条件下转化并异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（GST）蛋白。产物经SDS．PAGE电泳及Westernblot鉴定。结果PCR产物大小及双酶切鉴定证明所克隆的基因是hSIRT6，DNA测序进一步证实与GeneBank序列完全一致。获得高表达及纯化的SIRT6-GST融合蛋白，该可溶蛋白的相对分子质量为72×10^3，经Westernblot鉴定证实为目的蛋白。结论成功构建了基因重组体pGEX-4T-3／hSIRT6．并制备出可溶性SIRT6-GST融合蛋白。