依尼奥小单孢菌抗性基因sisR的克隆研究

从产西索米星的依尼奥小单孢菌中克隆高抗性新基因sisR ,借助计算机设计PCR引物 ,从西索米星的产生菌依尼奥小单孢菌的染色体DNA中 ,经PCR扩增获得DNA序列长度不等的DNA片段。将这些DNA片段克隆至pUC19载体质粒并导入大肠杆菌 ,从中筛选到 5个抗西索米星的转化子 (其中一个命名为sisR)显示对西索米星的高抗性 (超过 10 0 0 μg mL)。经DNA测序并通过互联网Blast比对 ,确认对该抗性负责的DNA片段是一个未见报道的新基因。

提高西索米星生产菌产量的遗传育种

在西索米星产生菌橄榄星孢小单孢菌无锡亚种Ｍ－４１的选育过程中，以常规诱变育种为主，结合一些综合处理方法，如原生质体再生、在８－甲氧基补骨酯存在下用近紫外光照射、氯化锂和紫外线的复合处理，筛选自身产物抗性解除反馈调节突变株，同时结合单菌落自然分离纯化法经几十代选育，得到了稳定高产菌株９６－３７，比原始野生型菌株产量提高近３０倍，主组分含量提高到８５％以上。经２０吨规模发酵罐试验，证实菌株９６－３７是一株高产、稳产的工业生产菌种。

抗生素西索米星发酵过程中次要组分的调控

在西索米星产生菌橄榄星孢小单孢菌Ｍ－４１的发酵代谢与产物合成的研究中，发现通过控制种子期菌丝的生长形态、培养基中磷酸盐含量，并在发酵过程中添加合适的抑制剂，可有效地减少发酵液中次要组分ｖｅｒｄａｍｉｃｉｎ的生物合成，增加主要组分西索米星的含量。

西索米星发酵工艺的优化控制

在用橄榄星孢小单孢菌M - 4 1发酵生产西索米星的过程中 ,通过优化控制种子期菌丝的生长形态、培养基中有机氮源质量和磷酸盐含量、pH、温度、搅拌速度、通气质量等条件 ,可以使西索米星发酵达到适应工业化生产的水平。在此条件下 ,西索米星的发酵效价可达到 545u/ml左右。

伊尼奥小单孢工程菌S_(96)培养特性研究

目的 :对伊尼奥小单孢工程菌S96的培养特性进行研究。方法 :采用单亲灭活原生质体融合技术 ,从伊尼奥小单孢菌融合的杂合体中筛选到的工程菌S96,根据培养特征比较 ,其菌丝形态特征 ,斜面培养特征 ,碳源利用特征和深层培养特征不同于出发菌株。结果 :工程菌S96几乎不产生色素 ,不利用可溶性淀粉 ,不产生孢子。但它在深层培养时 ,生长快 ,菌丝长 ,易成网 ,衰亡期大大推后 ,稳定期明显延长 ,可达 9d之久。结论 :工程菌S96的新特征是出发菌所没有的 ,是一株新的工程菌。

伊尼奥小单孢菌2-脱氧蟹肌醇胺脱氢酶基因sisP的克隆与表达

目的:克隆西索米星生物合成基因——2-脱氧蟹肌胺(DOIA)脱氢酶基因。方法:以庆大霉素生物合成基因簇(AY524043)中的DOIA脱氢酶基因gntP作为参考模板设计引物,从伊尼奥小单孢菌(Micromonospora inyoensis)中,通过PCR方法扩增参与西索米星生物合成的DOIA脱氢酶基因,经测序鉴定、序列分析,并通过表达载体对该基因进行异源表达。结果:PCR扩增到一条长约1 035 bp的条带,包含一个开放阅读框长1 023 bp,推测其编码含340个氨基酸残基的蛋白质(相对分子质量约36×103),与已报道的DOIA脱氢酶同源性很高,该基因在IPTG诱导下,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)实现过量表达,表达产物的相对分子质量与预测值一致。结论:通过PCR技术从伊尼奥小单孢菌中克隆到参与西索米星生物合成基因——DOIA脱氢酶基因,命名为sisP,GenBank登录号为EU200975。

伊钮小单孢菌2-脱氧蟹肌醇氨基转移酶基因sisM的克隆与表达

从伊钮小单孢菌(Micromonospora inyoensis)中扩增到参与西索米星生物合成基因sisM,其开放阅读框长1263bp,编码含421个氨基酸残基(44.3ku)的蛋白质。经Blast比对,该蛋白与已报道的L-谷氨酰胺:2-脱氧蟹肌醇(DOI)氨基转移酶有很高的同源性,据此推测sisM是编码DOI氨基转移酶的基因。该基因在IPTG诱导下.在大肠埃希菌BL21(DE3)实现了表达,表达产物的分子量与推测的一致。这是从伊钮小单孢菌克隆到的又一参与西索米星核心基团2-脱氧链霉胺(DOS)生物合成的新基因,该基因在GenBank的登录号为EU074791。

利用抗自身代谢物特性进行西索霉素菌种选育

经过诱变处理西索霉素产生菌，利用菌株抗自身代谢物特征，在添加高浓度的西索霉素的分离培养基上选育获得产生西索霉素比出发菌株单位高的突变株ＭＥ９７，经过薄层层析，生物效价测定，该突变株所产抗生素主要组份是西索霉素，总的抗生素效价提高，并且其它发酵特征也发生了改变．

ARTP诱变结合抗性筛选选育西索米星高产菌株

目的利用等离子体诱变,结合抗生素抗性筛选,获得西索米星高产菌株。方法首先通过链霉素抗性筛选,获得一株比出发菌株产抗能力高的S4;随后以S4为出发菌株,经等离子体处理40s,借助巴龙霉素抗性筛选,得到双重抗性菌株。最后对突变株进行再次诱变,并结合高浓度链霉素抗性筛选。结果获得一株高产突变株M. inyoensis SAAP22,比出发菌株效价提高了38.18%,具有稳定的遗传性能。结论通过等离子体诱变,结合抗生素抗性筛选,可有效提升伊尼奥小单孢菌的西索米星合成能力,所得高产菌株具有潜在应用价值。

西索米星生产菌株的诱变选育及工艺优化

利用原生质体常压室温等离子体(ARTP)诱变方法选育西索米星高产菌株,经诱变筛选获得一株高产菌株I4-10,其西索米星的生物效价达到1389 U/mL,较原始菌株提高了35.4%。通过对高产菌株I4-10进行碳源、氮源优化,确定可溶性淀粉和牛肉粉是突变菌株I4-10的最适碳源和氮源。进一步采用响应面实验设计方法优化发酵培养基,结果表明黄豆饼粉和DL-蛋氨酸的添加量为显著影响因素,经优化其最适添加质量浓度分别为32.78 g/L和1.75 g/L。在此最适工艺下,西索米星的生物效价提高至1849 U/mL,较原始菌株提高了80%。最后对原始菌及高产突变株中西索米星代谢途径及菌株生长相关的关键酶进行转录水平比较分析,初步解析了突变菌株I4-10高产西索米星的机制。

褐产色小单孢菌——一株新的西索米星产生菌

从云南省大理县分得的一株褐产色小单孢菌,孢子层呈橄榄绿色,在酪氨酸琼脂上能产生褐色素,孢子表面有棘刺状突起,分类学鉴别它为小单孢菌属的一株新种。其主要发酵产物经提取、精制和微生物、理化特性、耐药谱及波谱学研究证明为西索米星。

庆大霉素生物合成基因genY的研究

以绛红色小单孢菌G1008基因组为模板,构建genY基因缺失的同源重组质粒pFY103,经接合转移导入绛红色小单孢菌G1008和GK1101(△genK),筛选获得genY基因缺失工程菌GY105(△genY)和工程菌GKY205(△genK+genY),发酵、提取并经质谱检测分析代谢产物.结果表明,工程菌GY105和GKY205主要积累西索米星、庆大霉素C1a和C2b.证明genY基因缺失阻断了庆大霉素X2到G418的转化,说明genY基因参与庆大霉素生物合成过程中绛红糖胺C-6’位甲基化.

庆大霉素及其相关产物在工业底盘细胞中的高效合成

庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素,在临床上广泛应用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染。它可由棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora产生,生物合成途径清晰。为了提高庆大霉素的产量,本文以工业菌株M.echinospora J1-020为基础,确定庆大霉素合成基因簇信息,建立了稳定的遗传操作方法。在此基础上,使用强(kasOp*)、中(rpsLp-cf)、弱(ermE*)三种强度的启动子评估磷酸转移酶GenP的最适过表达水平,构建对应attB/attP位点整合突变株YC002、YC003、YC001。摇瓶发酵结果显示,YC001、YC002、YC003菌株的庆大霉素C组分的产量较原始菌株[(1008±57)mg/L]分别提高了16.9%[(1178±39)mg/L]、30.8%[(1319±29)mg/L]和18.8%[(1198±46)mg/L];同时,结合杂质含量,在以上三株菌株中确定了中强度启动子控制genP过表达的效果最佳,以此构建对应的稳定整合在基因组上的genP过表达菌株YC004。使得庆大霉素C组分摇瓶发酵产量提高了34.5%[(1427±37)mg/L]。此外,以工业菌株M.echinospora J1-020为底盘,构建genQ敲除菌株,获得了只产生G418单一组分的菌株YC005,其摇瓶发酵产量为460 mg/L。以YC004为出发菌株,依次敲除genB4、genK,获得了只产生西索米星单一组分的菌株YC007,其摇瓶发酵产量达1046 mg/L。综上,以该工业菌株M.echinospora J1-020为底盘,借助合理的代谢工程策略有望快速获得多种氨基糖苷类抗生素的高产菌株。

西索米星分批发酵过程动力学模型

采用伊尼奥小单孢菌F003为产生菌的西索米星发酵过程具有典型的非生长耦联特征,西索米星浓度大于0.50g/L将明显抑制产物合成.建立了符合不同时期微生物代谢特性的西索米星分批发酵动力学模型,并对模型参数进行了估计和回归,模型拟合偏差平方和≤6%,模型能很好地描述西索米星发酵过程菌体的生长、底物的消耗和产物的合成.菌体生长期动力学模型参数μm、Ks、Kx、m分别为：0.058 h-1、4.046 g/L、0.433 g/g、0.0001 g/（g·h）;产物合成期动力学模型参数μKx、K2、N、Yx、Yp、m分别为：0.058 h^-1、60.556 g/g、1.198 g/（g·h）、0.606、0.090 g/g、0.095 g/g、0.00173 g/（g·h）.验证实验表明,所建立的模型能较好地预测初始淀粉浓度为50.0～70.0 g/L时西索米星的发酵过程特性.