SIX1基因突变致鳃-耳综合征1例

鳃-耳-肾综合征(branchio-oto-renal syndrome,BORS)是一种罕见的常染色体显性遗传病,以听力损害、鳃裂、肾脏异常为主要特征,并伴有耳前凹陷、耳廓畸形、外耳道狭窄等表型,其发病率约1/40,000[1]。当患者存在与BORS相似症状但无肾脏异常时被称为鳃-耳综合征(branchio-oto syndrome,BOS)[2]。本文报道我院诊断的1例因SIX1基因突变致鳃-耳综合征患者的临床资料,同时对国内外关于SIX1基因突变致BORS/BOS进行文献复习,以提高临床医生对该疾病及该基因致病特点的认识。

Six1基因在肺癌组织表达水平及RNA干扰抑制其表达后对肺癌细胞生物学特性的影响

目的探讨Six1基因在肺癌组织表达及抑制其表达后对肺癌细胞增殖凋亡的影响。方法提取肺癌及癌旁组织蛋白,Western印迹检测Six1的表达; Six1-siRNA转染人肺癌A549细胞,分为空白组和阴性对照组(NC组)、Six1-siRNA组,转染48 h后通过Western印迹检测各组细胞Six1的表达; CCK8检测Six1-siRNA转染A549细胞24～72 h的细胞增殖;流式细胞术检测转染48 h的细胞凋亡率; Western印迹检测增殖相关蛋白细胞增殖核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族Bcl-2相关X蛋白(Bax)及Notch1信号通路Notch1和Hes1的蛋白表达。结果 Six1在肺癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0. 05); Six1-siRNA转染能明显降低A549细胞Six1的表达;与空白组比较,Six1-siRNA组细胞24～72 h的细胞增殖均显著降低,在48 h的细胞凋亡率显著升高,PCNA、Notch1和Hes1蛋白表达均显著降低,Bax蛋白表达显著升高(P<0. 05)。结论 Six1在肺癌组织中高表达,通过RNA干扰抑制其表达可通过下调Notch1信号通路降低肺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡,对细胞增殖凋亡的影响方式是下调PCNA和上调Bax蛋白表达。

下调Six1基因表达对胃癌细胞生物学特性及B7-H1表达的影响

目的探讨抑制胃癌细胞Six1表达对癌细胞增殖侵袭及B7-H1表达的影响及机制。方法以人正常胃黏膜上皮细胞GES-1为对照细胞,Western印迹检测胃癌MKN45、BGC823和AGS细胞Six1的蛋白表达;参照LipofectamineTM2000转染说明将非特异性siRNA(NC组)和Six1特异性的siRNA(si-Six1组)转染BGC823细胞,并设置空白对照组,转染48 h,通过MTT及Transwell小室分别检测各组细胞活力及侵袭能力;Western印迹检测Six1、B7-H1及JAK2/STAT3信号通路磷酸化的JAK2、STAT3及下游分子细胞周期蛋白(cyclin)D1和基质金属蛋白酶(MMP)-2的蛋白表达。结果胃癌MKN45、BGC823和AGS细胞Six1的表达均显著高于在GES-1细胞表达(P<0.05);转染si-Six1的BGC823细胞Six1的蛋白表达显著低于空白对照组(P<0.05);与NC组比较,si-Six1组细胞活力及侵袭能力均显著降低,B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1和MMP-2的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论下调胃癌细胞Six1表达可降低癌细胞活力及侵袭能力,降低B7-H1表达,机制可能是抑制JAK2/STAT3信号通路。

人Six1基因促进肺腺癌细胞A549的增殖

目的:构建带有Flag标签的Six1基因的慢病毒表达载体,并对表达产物Flag-Six1的生物学功能进行初步鉴定。方法:以实验室构建的真核表达载体myc-Six1为模板,根据实验需求合成引物,经PCR扩增,酶切后插入pCDHFlag载体,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;经Western印迹鉴定无误后,与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染人肺癌细胞A549,经嘌呤霉素筛选2周,收集部分细胞,用Western印迹验证蛋白水平的表达,并通过细胞生长实验检测Six1对A549细胞生长的影响;提取RNA,通过qRT-PCR检测细胞中血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)在mRNA水平的变化。结果:构建的慢病毒表达载体pCDH-Flag-Six1能够在293T细胞中正确表达;包装成慢病毒,感染肺癌细胞A549后可正常表达;生长曲线表明Flag-Six1可促进人肺癌细胞A549的繁殖;qRTPCR结果表明Six1可升高肺癌细胞A549的VEGF-C转录水平。结论:构建了带pCDH-Flag标签的人Six1基因慢病毒表达载体,Flag-Six1能够在肺癌细胞系A549中表达,并能促进细胞增殖,这为进一步研究Six1的生物学功能奠定了重要基础。

Six1基因对As2O3诱导的口腔鳞癌细胞凋亡和ROS水平的影响研究

目的探讨Six1 siRNA或三氧化二砷(As2O3)对口腔鳞癌细胞活力、凋亡及活性氧(ROS)水平的影响。方法实验分为空白对照组(无需处理)、Six1-siRNA组(细胞转染Six1的特异性siRNA)、As2O3组(终浓度为5μmol/L As2O3处理细胞)和Six1-siRNA+As2O3组(Six1-siRNA及As2O3共同处理细胞)4个组,siRNA转染参照Lipofectamine TM 2000说明。人口腔鳞癌CAL-27细胞处理48 h,Western blotting检测Six1及Wnt/β-catenin信号相关的β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达。CCK8及流式细胞术分别检测细胞活力、凋亡率及ROS含量。结果Six1siRNA的转染可明显降低CAL-27细胞Six1的蛋白表达,与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,Six1-siRNA组和As2O3组细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,ROS含量明显升高,β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达明显降低(P<0.05),而联合使用的细胞活力及β-catenin、Cyclin Dl和Survivin的蛋白表达均显著低于Six1-siRNA组和As2O3组,凋亡率及ROS含量高于Six1-siRNA组和As2O3组(P<0.05)。结论Six1-siRNA可增加As2O3对口腔鳞癌细胞凋亡的诱导,机制与增加细胞ROS水平及下调Wnt/β-catenin信号有关。

SIX1基因表达及其多态性与绵羊季节性繁殖和产羔数的关联分析

为探究繁殖组织中SIX1基因的表达水平及其多态性与绵羊季节性繁殖和产羔数之间的关系,本实验通过实时荧光定量PCR(qPCR)研究SIX1基因在不同产羔数(单羔组和多羔组)小尾寒羊卵巢、子宫体、输卵管组织中的表达情况,同时利用Sequenom MassARRAY?SNP技术检测多羔品种(小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊共560只)和单羔品种(滩羊、苏尼特羊、草地型藏羊共204只)中SIX1基因g.69738971 T>G的多态性,并与其中有产羔数记录的380只小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:SIX1基因在小尾寒羊卵巢、子宫体、输卵管组织中均表达,且单羔组的子宫体中SIX1基因表达量显著高于多羔组(P<0.05);分型结果表明,SIX1基因g.69738971 T>G位点共存在TT、GT和GG 3种基因型,且基因型频率和等位基因频率在单、多羔品种(即高、低繁殖性能的母羊)间差异均极显著(P<0.01);卡方适合性检验表明,该位点在6个绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);该位点多态性与小尾寒羊第1、2及第3胎产羔数均显著相关(P<0.05),即野生型(TT)各胎产羔数均显著高于突变型(GT和GG)。综上,SIX1基因表达与绵羊繁殖有关,该基因表达水平与绵羊产羔数可能存在一定程度的负相关,其g.69738971 T>G位点可作为控制绵羊季节性繁殖和产羔数性状的一个潜在分子标记位点。

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建带myc标签的Six1基因的真核表达载体,获得myc-Six1融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Six1编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果:双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT-PCR结果表明myc-Six1可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论:构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。

先天性小耳畸形EYA1和SIX1基因检测分析

目的了解先天性小耳畸形患者是否存在EYA1和SIX1基因突变。方法选择先天性小耳畸形患者100例,包括13个家系的先证者和家系其他患病成员共31人及散发患者69人,其中,小耳畸形伴耳前凹34例,小耳畸形伴耳前赘或副耳22例,小耳畸形伴腭裂8例,小耳畸形伴面部不对称21例,单纯小耳畸形15例,通过PCR和直接测序对EYA1和SIX1基因进行突变检测。结果检测到4种EYA1核苷酸改变,分别为258G>A(Q86Q)、813A>G(T271T)、1278C>T(G426G)和1755T>C(H585H)。1例散发患者检测到SIX1外显子1非编码区219位C>T;另2例散发患者SIX1外显子1～28位碱基G缺失。结论本实验未在先天性小耳畸形伴耳前凹、耳前赘患者中发现EYA1和SIX1基因已知热点突变。

Six1基因siRNA联合雷公藤内酯醇对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制

目的探讨Six1基因siRNA联合雷公藤内酯醇(TRL)对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制。方法参照脂质体Lipofectamine Tm2000转染说明将si-Six1瞬时转染生长至对数期的人骨肉瘤MG63细胞,50 ng/ml·ml TRL处理细胞,随机分为NC组(转染合成的非特异性的siRNA)、si-Six1组(干扰Six1表达的特异性的siRNA)、TRL醇组(50 ng/ml的TRL处理细胞)和si-Six1+TRL组(在转染si-Six1的基础上加入TRL),Western blotting检测Six1、p-JAK2、pSTAT3、cyclin D1、Bax、MMP-2的蛋白表达;CCK8检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Transwell小室检测细胞侵袭能力。结果转染si-Six1的MG63细胞Six1的蛋白表达显著低于NC组(P<0.05);与NC组比较,si-Six1组和TRL组细胞活力均明显降低,细胞凋亡率显著升高,细胞侵袭能力显著降低,p-JAK2、p-STAT3、cyclin D1和MMP-2的蛋白表达均显著降低,Bax蛋白表达显著升高(P<0.05),而联合使用si-Six1组和TRL对细胞活力、凋亡率、侵袭能力及JAK2/STAT3信号的影响强于单独用si-Six1或TRL。结论抑制Six1表达及TRL均能有效的抑制骨肉瘤细胞活力及侵袭能力,诱导细胞凋亡,两者联合作用更强,其机制可能与下调JAK2/STAT3信号通路有关。

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。

绵羊不同繁殖状态下SIX1和TEF基因的表达特征分析

试验旨在探究SIX1和TEF基因在苏尼特羊(Sunite sheep,SNT)和小尾寒羊(Small Tail Han sheep,STH)相关组织中的表达特征,有助于揭示上述2个基因在绵羊季节性发情和繁殖调控中的重要作用。选取季节性发情的SNT母羊在短光照(模拟繁殖季节)和长光照(模拟休情期)条件下及常年发情的STH母羊在不同繁殖时期(卵泡期和黄体期)的下丘脑等10种组织,利用qPCR技术分析上述不同繁殖状态下各组织中SIX1和TEF基因的相对表达量。结果表明,SIX1基因在SNT和STH的垂体组织中均高表达,其它组织中微弱表达;TEF基因在2个绵羊品种的多个组织中广泛表达;SNT垂体中TEF基因在短光照条件下其表达量显著高于长光照条件(P<0.05),STH垂体中TEF基因在卵泡期其表达量显著高于黄体期(P<0.05);SNT子宫体中TEF在长光照条件下其表达量显著高于短光照条件(P<0.05),STH子宫体中TEF在黄体期其表达量极显著高于卵泡期(P<0.01)。研究结果显示,SIX1和TEF基因表达在绵羊垂体中发挥重要作用,2个基因在SNT垂体中的表达变化趋势与已知的长光照诱导基因EYA3的表达变化不同,暗示绵羊垂体中SIX1和TEF基因不是通过转录水平变化来参与季节性发情上游基因的调控;TEF基因可能参与绵羊不同繁殖状态下子宫生理变化的调控。本研究为深入探究这2个基因在绵羊繁殖性能调控方面的作用奠定了基础。

人Six1真核表达载体的构建及应用

Six1（sineoculis homeobox homolog 1,Six1）是一种转录调控因子,属于同源盒基因家族成员,是转录因子E2F1的转录靶基因,激活G1/S期的转录,增加S期转录水平,并通过激活靶基因如细胞周期蛋白A1（cyclin A1）、cyclin D1等,启动靶基因转录,从而抑制与DNA结合能力,最后被蛋白酶水解[1]。当Six1过表达时,这一作用则被削弱,

鳃-耳-肾综合征1例

鳃-耳-肾综合征是一种较为罕见的常染色体显性遗传性疾病。其临床表现主要为耳部畸形、鳃裂异常和肾发育异常。本例患者在我院2018年12月接受人工耳蜗植入,现将其诊疗过程,及术后效果报道如下。1简要病史患儿,女,1岁2个月,因听筛未过入院。确诊双耳极重度感音神经性聋8个月。出生发现左侧颌下肿物伴右侧瘘口,有分泌物挤出。

人脑胶质瘤组织Six1、IGF2蛋白表达与临床病理特征、细胞增殖和预后的关系

目的探讨人脑胶质瘤组织同源异形框基因Six1、胰岛素样生长因子-2(IGF2)蛋白表达与临床病理特征、细胞增殖和预后的关系。方法选取2016年1月至2018年1月该院切除的80例人脑胶质瘤组织设为观察组,另选取同期该院切除的40例非肿瘤脑组织设为对照组。采用免疫组化法检测两组患者脑组织Six1、IGF2蛋白的阳性表达水平,对比蛋白阳性表达和阴性表达患者的Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)标记指数(LI),并分析Six1、IGF2蛋白表达与患者临床病理特征的关系,用Pearson相关分析Six1与IGF2表达水平的相关性,Kaplan-Meier生存分析研究Six1、IGF2蛋白表达与患者预后的关系,多因素COX回归模型分析人脑胶质瘤患者预后的影响因素。结果观察组Six1、IGF2蛋白阳性表达率分别为65.00%、47.50%,均明显高于对照组的22.50%、12.50%,差异均有统计学意义(P<0.05)。人脑胶质瘤患者肿瘤分化程度越低,Six1、IGF2蛋白阳性表达率越高(P<0.05)。Six1、IGF2蛋白阳性表达患者的Ki-67 LI、PCNA LI均明显高于阴性表达患者(P<0.05);随着Six1、IGF2蛋白阳性表达程度增加,Ki-67 LI、PCNA LI随之升高(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,Six1与IGF2蛋白在人脑胶质瘤组织中表达水平呈正相关(r=0.399,P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,Six1、IGF2蛋白阴性表达患者随访3年的生存率分别高于Six1、IGF2蛋白阳性表达患者(Log-rankχ^(2)=4.029、4.903,P=0.045、0.027)。COX回归分析结果显示,低肿瘤分化程度、Six1阳性表达、IGF2阳性表达均是影响人脑胶质瘤患者预后的危险因素(P<0.05)。结论人脑胶质瘤患者肿瘤组织Six1、IGF2蛋白呈高水平表达,其表达水平与人脑胶质瘤的肿瘤分化程度、肿瘤细胞增殖、患者预后密切相关。

SIX1、E-cad在子宫内膜增生性病变组织中的表达及意义

目的:探究单纯性增生患者、复杂性增生伴非典型增生患者内膜组织中同源盒基因SIX1、上皮型黏附素(E-cad)mRNA和蛋白表达及意义。方法:选取2019年12月-2021年3月于本院就诊并行刮宫术的159例子宫内膜增生性病变患者的病变内膜组织标本,其中单纯性增生(单纯增生组)81例,复杂性增生伴非典型增生(复杂增生组)78例;选取同期子宫内膜癌患者83例正常子宫内膜组织作为内膜癌组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测3组内膜组织SIX1、E-cad mRNA水平,免疫组织化学法检测内膜组织中SIX1、E-cad蛋白表达;采用Pearson法、Spearman法分析子宫内膜增生性病变患者SIX1与E-cad mRNA水平及蛋白表达相关性。结果:复杂性增生组SIX1 mRNA水平及蛋白表达阳性率最高、单纯增生组次之、内膜癌组最低,E-cad mRNA水平及蛋白表达阳性率最低、单纯增生组次之、内膜癌组(P<0.05);单纯增生组SIX1 mRNA水平及蛋白表达阳性率高于内膜癌组,E-cad mRNA水平及蛋白表达阳性率低于内膜癌组(P<0.05)。单纯性增生及复杂性增生伴非典型增生患者SIX1与E-cad mRNA水平均呈负相关(r=-0.664、-0.572,P<0.05),SIX1与E-cad蛋白表达均呈负相关(r=-0.354、-0.424,P<0.05)。结论:子宫内膜增生性病变患者内膜组织中SIX1表达水平升高,E-cad表达水平降低,其异常表达可能与子宫内膜增生的发病有关。

鳃耳综合征/鳃耳肾综合征的遗传学研究进展

鳃耳综合征(branchio-oto syndrome,BOS)/鳃耳肾综合征(branchio-oto-renal syndrome,BORS)是一种不常见的常染色体显性遗传综合征型疾病,人群发病率约为1/40000,以听力障碍及耳的表现为最主要特征,并伴有肾脏畸形及鳃裂囊肿或瘘管等症状。耳畸形是BOS/BORS最明显的临床表现之一,包括外耳、中耳、内耳畸形和听力障碍。听力障碍又分为传导性、感音神经性或混合性,程度可轻可重。颞骨影像学可以帮助临床医生诊断中耳和内耳畸形。直接测序结合二代测序(next generation sequencing,NGS)、多重连接扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)和比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)等技术可有效筛选及鉴定BOS/BORS致病基因及突变类型。EYA1基因突变是引起BOS/BORS最主要的遗传学病因,约40%的患者携带此基因突变,目前已在不同人群中报道了240种EYA1基因致病突变,包括移码、无义、错义、异常剪接、缺失和复杂重排。人类内源性反转录病毒序列(human endogenous retroviral sequences,HERV)可能在介导非等位同源重组引起的EYA1染色体片段缺失突变中发挥重要作用。EYA1编码一种与SIX1转录因子协同作用的磷酸酶反式激活因子,参与颅感觉神经的发生和鳃弓衍生器官的发育,调节外耳、中耳和内耳形态和功能的正常分化。此外,SIX1和SIX5基因的致病突变也会导致BOS/BORS,以上3种基因的突变可能通过破坏SIX1-EYA1、SIX5-EYA1蛋白质结合或SIX1-DNA的结合而致病,但SIX5基因在BORS致病中的作用仍需进一步验证。