HepG2细胞Six4蛋白表达对细胞增殖、迁移和上皮-间充质转化的影响

目的体外观察敲除HepG2细胞Six同源盒蛋白4(Six4)对细胞增殖、迁移和上皮-间充质转化的影响。方法采用Six4慢病毒shRNA感染HepG2细胞,筛选基因敲除细胞和正常对照细胞,采用CCK-8和5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)染色检测细胞增殖,采用Transwell小室实验检测细胞迁移,采用Western blot法检测蛋白表达。结果基因敲除细胞吸光度、EdU染色阳性率和侵袭细胞数分别为(1.19±0.22)、(31.63±7.43)%和(65.71±10.02)个,均显著低于正常对照细胞【分别为(2.18±0.30)、(76.51±8.84)%和(120.14±11.85)个,P<0.05】;基因敲除细胞E-cadherin表达显著强于,而N-cadherin、Vimentin和Six4蛋白表达显著弱于正常对照组细胞,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HepG2细胞SIX4对细胞活力和上皮-间充质转化有重要影响,可能成为潜在的治疗靶点需要进一步研究。

SIX4在子宫内膜癌中的表达与临床意义及其对Ishikawa细胞侵袭和迁移的影响

目的探究同源异型盒基因4(sine oculis homeobox homolog 4,SIX4)在子宫内膜癌组织中的表达、临床意义及其对Ishikawa细胞侵袭和迁移的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测SIX4在子宫内膜癌组织(内膜癌组)及正常内膜组织(对照组)的表达水平,并分析其与内膜癌组患者临床病理特征的相关性;将Ishikawa细胞分为正常组(空白对照组)、阴性对照组(转染siRNA-NC组)和抑制组1(转染siRNA-1组),抑制组2(转染siRNA-2组),抑制组3(转染siRNA-3组),RT-qPCR法检测各组SIX4表达量。Western blot法检测各组细胞SIX4、E-cadherin及N-cadherin的蛋白表达水平;Transwell实验、划痕实验分别检测各组细胞侵袭和迁移能力。结果与对照组比较,SIX4在内膜癌组中的表达水平较高(P<0.05),且SIX4高表达与子宫内膜癌的临床分期、肌层浸润深度、淋巴结转移情况相关(P<0.05),但与年龄、组织类型和分化程度均无关(P>0.05);siRNA抑制SIX4表达后,RT-qPCR法检测结果显示,抑制组2干扰效果最佳。Western blot法检测结果显示,抑制组相较于正常组及阴性对照组E-cadherin表达升高,SIX4和N-cadherin表达降低。Transwell实验及划痕实验结果显示,抑制组细胞的侵袭和迁移能力均较正常组及阴性对照组显著降低(P<0.05)。结论SIX4在子宫内膜癌组织中呈现高表达,其高表达与子宫内膜癌的不良病理特征相关;siRNA靶向抑制SIX4的表达可通过上皮间充质转化通路抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移。

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。

SIX4基因在肿瘤中的研究进展

Six同源盒蛋白4 (Six homeobox 4, Six4)是同源盒蛋白(Sinooculis homologous box, SIX)家族中的成员之一,是机体生长发育过程中不可或缺的决定因子,参与胚胎细胞的生长与分化,并在肌细胞的生成及调节中起到重要作用。已有学者研究揭示了,SIX4的表达异常促进了肿瘤的发生、发展进程。此外,SIX4基因可以作为许多微小RNA (miRNA)的靶基因,可以同时作为转录抑制因子和激活剂调控癌细胞启动、增殖和转移,研究SIX4的详细致癌机制在肿瘤形成过程中的作用,能够为临床在肿瘤治疗方面开阔新的视野,将来SIX4基因有望成为新的癌症靶标,用来指导临床肿瘤靶向治疗。本文将从SIX4基因的基本概况、生物遗传学特征、在实体肿瘤中的分子通路及其与miRNA的关系等四个方面来阐述SIX4基因的最新研究进展。

同源异形框蛋白Six4在肝细胞癌中的表达及生物学功能研究

目的研究Six4在肝细胞癌(HCC)组织中表达与预后的关系,探索Six4在HCC细胞系中的生物学作用。方法应用组织芯片技术、免疫组织化学(IHC)、实时定量PCR(RT-PCR)、蛋白免疫印记(WB)检测Six4在HCC癌组织及相应癌旁、正常肝组织中的表达情况,分析Six4蛋白表达与HCC患者预后的关系;通过HCC细胞系培养、慢病毒介导RNA干扰技术(Lv-shRNA)、Transwell迁移实验、平板克隆、低黏附培养、CC8细胞增殖检测和裸鼠皮下荷瘤实验进一步明确Six4在HCC细胞中功能。结果 Six4蛋白在癌组织中表达较高。癌组织中,Six4蛋白主要定位在细胞核里;而在对应的癌旁组织中,很少有阳性的染色区域。对263例配对HCC组织染色状况进行统计,癌组织中呈现高表达183例,两者接近52例,低于癌旁染色28例。通过RT-PCR检测发现,癌组织中Six4的mRNA显著高于各自的癌旁组织和远端正常组织,且正常肝组织、癌旁组织和癌组织间差异有显著性。WB检测提示Six4蛋白在癌组织匀浆中表达更高。对263例HCC肿瘤样本进行评分和分级,0~1分113例;2~3分150例。高表达Six4的患者平均总生存期为25.7个月,低表达Six4患者为40.5个月;高表达Six4的患者平均无进展生存期为12.7个月,低表达Six4患者为21.3个月;与低表达Six4患者相比,高表达Six4患者生存时间更短,预后更差,差异有显著性。Six4在男性样本中表达水平高于女性;Six4表达越高,肿瘤越大,患者门静脉侵犯比例越高,BCLC分期和TNM分期也越差,提示患者的不良预后。IHC染色显示Six4蛋白在PVTT中表达高于原发癌组织,核阳性率也显著升高;PVTT中Six4的mRNA显著高于各自的原发肿瘤、癌旁和正常肝组织,且远端正常肝组织、癌旁组织、癌组织、癌栓组织间差异有显著性;WB检测也提示Six4蛋白在PVTT组织匀浆中表达更高。结论 Six4蛋白在HCC原发癌组织和癌栓组织中呈现高表达,其表达水平与HCC患者预后密切相关,可作为临床预测食管鳞癌患者预后的指标。

Six4蛋白在结肠癌中的表达及临床意义

目的:探索Six4蛋白在结肠癌中的表达及其与临床特征的关联性.方法:通过医学癌症数据库分析Six4表达与结肠癌患者生存时间的相关性;利用组织芯片,通过免疫组化检测结肠癌组织及癌旁组织中Six4蛋白的表达情况,统计分析其表达差异,分析Six4蛋白表达与结肠癌患者的临床特征及预后的关系.结果:Six4高表达结肠癌患者生存期较低表达患者明显缩短(P=0.002).在结肠癌组织中Six4蛋白表达显著高于癌旁组织(P<0.001).Six4表达水平与结肠癌患者病理分期(P=0.020)、肿瘤大小(P=0.034)、MSH6表达水平(P=0.035)有相关性,而与性别、年龄、淋巴结转移、是否远处转移、TNM分期、Ki67、P53、MSH2蛋白表达水平无明显相关性.Six4蛋白的表达水平(P=0.029)可以作为结肠癌患者的独立预后因素.结论:Six4蛋白高表达与不良预后相关;Six4蛋白在结肠癌组织较癌旁组织高表达;Six4蛋白与病理分期、肿瘤大小、MSH6表达水平相关.

汉黄芩素调控miRNA-135b-3p靶向SIX4抑制A549细胞上皮间质转化的分子机制

目的 探究汉黄芩素对人非小细胞肺癌A549细胞侵袭转移的影响及其对上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的作用和分子机制。方法 MTT试验检测汉黄芩素对A549细胞的毒性作用,HE染色观察汉黄芩素处理前后A549细胞形态学变化,划痕试验、Transwell小室试验检测侵袭转移能力,Western blotting和qRT-PCR测定EMT相关标志物表达情况。利用高通量测序技术,检测汉黄芩素处理TGF-β1诱导的A549前后差异表达的miRNA,进行qRT-PCR验证;划痕试验、Transwell小室试验分析细胞转染miRNA mimic、inhibitor和NC后A549细胞侵袭转移能力,Western blotting和qRT-PCR测定EMT相关标志物的表达情况。运用GO和KEGG数据库分析,找出目标miRNA作用的靶基因;Western blotting和qRT-PCR验证miRNA mimic、inhibitor和NC转染后靶基因及蛋白的表达情况;双荧光素报告酶基因试验证明该miRNA对靶基因翻译的调控作用。结果 汉黄芩素可抑制A549细胞的生长增殖,上调TGF-β1诱导的A549细胞E-cadherin及下调Vimentin的表达,降低细胞迁移的能力,逆转细胞的形态变化。高通量测序得到差异表达的miRNA,其中汉黄芩素可逆转miRNA-135b-3p在A549细胞EMT过程中的过表达,抑制A549细胞的侵袭和转移。信号通路分析及miRNA数据库靶基因预测miRNA-135b-3p可调控SIX4的表达。双荧光素报告基因试验显示miRNA-135b-3p可结合于SIX4基因的3’-UTR产生调控,Western blotting、qRT-PCR证明过表达miRNA-135b-3p的A549细胞SIX4表达降低,敲低miRNA-135b-3p后可恢复。结论 汉黄芩素调控miRNA-135b-3p靶向SIX4抑制A549细胞的侵袭转移和EMT过程。

SIX1和SIX4蛋白在结肠腺瘤性息肉中的表达和意义

目的探索SIX1和SIX4蛋白在结肠腺瘤性息肉中的表达及意义。方法利用组织芯片及组织切片,通过免疫组化检测结肠腺瘤性息肉组织、结肠癌组织及癌旁组织中SIX1和SIX4蛋白的表达情况,分析结肠腺瘤性息肉中SIX1和SIX4蛋白表达的意义。结果结肠腺瘤性息肉组织中SIX1、SIX4蛋白表达低于结肠癌组织,高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05);SIX1、SIX4蛋白表达在结肠腺瘤性息肉内定位于结肠上皮细胞质及细胞膜。结论SIX1和SIX4可能在结肠腺瘤性息肉发生过程中发挥作用,检测SIX1和SIX4蛋白表达有助于结肠癌的早期诊断。

敲低SIX4对食管癌细胞系增殖能力的影响

目的研究敲低SIX4对食管癌细胞系增殖能力的影响。方法在食管癌细胞中找到SIX4高表达的细胞系;用慢病毒介导的shRNA敲低技术干扰SIX4的表达,构建出SIX4稳定敲低的细胞系;利用CCK-8试剂盒和平板克隆形成实验检测敲低SIX4后对食管癌细胞系增殖能力的影响。结果食管癌细胞系KYSE70和KYSE450中SIX4的表达量相对较高,在KYSE70和KYSE450中敲低SIX4后显著抑制细胞的增殖能力。结论 SIX4的高表达可以促进食管癌细胞的增殖,在KYSE70和KYSE450中敲低SIX4后显著抑制细胞的增殖能力。