RNAi下调Six1基因对人骨肉瘤细胞增殖和转移能力的影响

背景与目的:Six1(sine oculis homeobox homolog1)基因的编码产物属于复合同源异型蛋白家族一员,主要参与中枢神经系统、眼、肾、肌肉等组织器官的发育。最新的研究表明Six1也参与了调控转录和细胞周期,进而发现与恶性肿瘤的发生及转移相关。在骨肉瘤中,Six1的功能还未完全明确。本研究拟对Six1在人骨肉瘤细胞增殖和转移中所发挥的作用进行初步探讨。方法:以人骨肉瘤MG-63细胞系为研究对象,针对其Six1基因序列设计小干扰RNA片段,筛选出能高效沉默目标基因的片段序列后,重组其短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体,转染入细胞,筛选出稳定表达干扰质粒的细胞克隆。用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)方法分别检测转染后Six1的mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝法检测增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,并将肿瘤细胞注入裸小鼠体内进行肿瘤转移的观察。结果:RT-PCR和Western blot显示shRNA对Six1在基因和蛋白水平均有显著的下调作用。骨肉瘤细胞的生长速度减慢,处于G2-M期的细胞比例由25.62%±1.81%下降为18.25%±1.56%,处于G1期的细胞比例由57.31%±2.11%上升到65.51%±2.65%。裸鼠转移瘤实验发现转移瘤的抑制率为69.5%。结论:下调Six1基因后,骨肉瘤细胞的增殖和转移能力都得到了明显的抑制,有可能成为临床治疗骨肉瘤的靶点之一。

miR-185靶向Six1对肺癌上皮-间质转化过程的影响及其机制

目的探讨miR-185影响人肺癌细胞迁移和侵袭能力的分子机制。方法在肺癌细胞系H520和A549中转染miR-185mimic获得miR-185过表达,利用Transwell实验和细胞划痕实验检测细胞的迁移和侵袭能力;荧光素酶报告实验验证miR-185靶向Six1基因;采用qRT-PCR和Western blot法检测miR-185对细胞中Six1基因表达水平的影响;Western blot法检测miR-185过表达对肺癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程的影响。结果 miR-185过表达降低肺癌细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05),上皮细胞标志物E-cadherin表达升高(P<0.01),间质细胞标志物vimentin表达降低(P<0.01),H520细胞过表达miR-185后,Six1基因表达水平降低(P<0.01),miR-185调控肺癌细胞的迁移和侵袭是通过靶向Six1基因实现的。结论 miR-185靶向Six1基因调控人肺癌细胞EMT途径。

Six1基因异常表达促癌机制及药物靶点

Six1基因在肿瘤中表达异常增高,如乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌及白血病等。过表达的Six1调控癌细胞的增殖、抑制肿瘤细胞的凋亡,促进上皮间质转化及新血管、淋巴管生成,通过转录及蛋白互作调控相关靶基因。本文概括了Six1基因过表达的促癌机制,集中于Six1如何影响TGFβ通路及这一网络中可能的药物靶点。

人Six1基因促进肺腺癌细胞A549的增殖

目的:构建带有Flag标签的Six1基因的慢病毒表达载体,并对表达产物Flag-Six1的生物学功能进行初步鉴定。方法:以实验室构建的真核表达载体myc-Six1为模板,根据实验需求合成引物,经PCR扩增,酶切后插入pCDHFlag载体,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;经Western印迹鉴定无误后,与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染人肺癌细胞A549,经嘌呤霉素筛选2周,收集部分细胞,用Western印迹验证蛋白水平的表达,并通过细胞生长实验检测Six1对A549细胞生长的影响;提取RNA,通过qRT-PCR检测细胞中血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)在mRNA水平的变化。结果:构建的慢病毒表达载体pCDH-Flag-Six1能够在293T细胞中正确表达;包装成慢病毒,感染肺癌细胞A549后可正常表达;生长曲线表明Flag-Six1可促进人肺癌细胞A549的繁殖;qRTPCR结果表明Six1可升高肺癌细胞A549的VEGF-C转录水平。结论:构建了带pCDH-Flag标签的人Six1基因慢病毒表达载体,Flag-Six1能够在肺癌细胞系A549中表达,并能促进细胞增殖,这为进一步研究Six1的生物学功能奠定了重要基础。

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建带myc标签的Six1基因的真核表达载体,获得myc-Six1融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Six1编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果:双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT-PCR结果表明myc-Six1可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论:构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。

Six1基因启动子未甲基化在宫颈癌病情及预后评估中的价值

目的研究Six1基因启动子未甲基化在宫颈癌病情及预后评估中的价值。方法选择宫颈癌患者(CER组)和正常健康女性(CON组)各80例为研究对象,采用甲基化特异性PCR(MSP法)检测CER组肿瘤组织、癌旁正常组织及CON组宫颈活检组织Six1基因启动子甲基化状态,分析Six1基因启动子甲基化与临床病理因素的关系,比较CER组中Six1基因启动子甲基化和未甲基化患者术后2年死亡率和无进展生存期(PFS)的差异。结果 CER组肿瘤组织Six1基因启动子甲基化率低于癌旁组织和CON组,差异有统计学意义(P﹤0.05),而CER组癌旁组织与CON组的Six1基因启动子甲基化率差异无统计学意义(P﹥0.05)。CER组肿瘤组织Six1基因启动子甲基化率在年龄和病理类型中的差异均无统计学意义(P﹥0.05),在HPV感染、分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、远处转移和FIGO分期中差异有统计学意义(P﹤0.05)。CER组Six1启动子甲基化患者2年病死率低于启动子未甲基化患者,PFS高于启动子未甲基化患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论宫颈癌发病机制可能与Six1基因启动子甲基化缺失有关,Six1基因启动子未甲基化在宫颈癌病情及预后评估中具有重要价值。

大肠癌组织中Six1和CyclinD1的表达及其临床意义

目的探讨胚胎发育调节因子（Six1）和细胞周期蛋白D1（CyclinD1）在大肠癌组织中的表达及其临床意义，分析Six1和CyclinD1表达的相关性。方法采用免疫组化EnVision法检测65例大肠癌组织和20例癌旁正常组织中Six1和CyclinD1的表达。结果大肠癌组织中Six1和CyclinD1的阳性表达率分别为70．77％和60．00％，均明显高于癌旁正常组织的15．00％和0％，组间比较差异有统计学意义（P〈O．05）。Six1和CyclinD1表达与大肠癌患者临床分期、浸润深度及淋巴结是否转移有关（P〈0．05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度无关（P〉O．05）。大肠癌组织中Six1和CyclinD1的表达呈正相关（P〈O．05）。结论six1和cyclinD1过表达可能与大肠癌的发生、发展密切相关。联合检测Six1和CyclinD1表达可用于评估大肠癌的浸润、转移能力和预后。

Ezrin在肿瘤转移中的作用及机制研究进展

恶性肿瘤的远处转移是肿瘤治疗中的难点之一。Ezrin为膜细胞骨架连接蛋白．在多种恶性肿瘤中，Ezrin高表达与肿瘤转移密切相关，其通过改变肿瘤细胞极性及细胞运动、调节肿瘤细胞间黏附及细胞与细胞外基质黏附、参与肿瘤细胞内信号转导而影响恶性肿瘤转移．现对Ezrin在肿瘤转移巾的作用、作用机制及其高表达分子调节机制的研究进展作一综述。

肉鸭Six1基因第2外显子单核苷酸多态与屠体性状的相关性分析

Six1基因是调控肌肉形成过程中的重要基因。为研究Six1作为肉鸭生长发育候选基因的可行性,本实验以42日龄大型肉鸭为研究对象,采用PCR-SSCP技术检测肉鸭Six1基因第2外显子的多态性,并对所检测到的多位点组成的基因型与肉鸭屠体性状进行关联性分析。结果表明:在鸭Six1基因的编码区第729 bp处存在C→T突变,属同义突变,该突变位点在大型肉鸭群体中表现为AA与AB 2种基因型。肉鸭AA和AB基因型间,胸肌重、腿肌重和其他屠体性状差异不显著(P>0.05)。以上结果表明,鸭Six1基因第2外显子区没有适用于遗传标记的多态位点。

Six1基因在乳腺癌中的研究进展

同源盒基因Six1是一种转录因子，在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥作用，与乳腺癌的发生、发展过程也密切相关。目前对Six1的研究较多，结果显示，其过表达可诱导乳腺干细胞的活化、激活TGF—Bate通路和Wnt／β-catenin通路，促使乳腺上皮细胞发生上皮间质转变，进而恶变形成肿瘤。本文对Six1在乳腺癌发生、发展中的作用及分子机制研究进展进行总结。

Six1基因在乳腺癌组织表达及RNA干扰其表达对癌细胞增殖侵袭能力的影响

目的探讨Sixl基因在乳腺癌组织表达及RNA干扰其表达对癌细胞增殖侵袭能力的影响。方法通过RT-PCR及Western印迹分别检0n,4Sixl在乳腺癌组织的mRNA及蛋白表达；通过脂质体Lipofectami．neTM2000将Sixl的小干扰RNA（siRNA）（Sixl-siRNA组）转染人乳腺癌MDA-MB．231细胞，设置空白对照组和阴性对照组（NC组），转染48h后检测各组细胞中Sixl的蛋白表达；细胞计数试剂盒（CCK8）法检测细胞活力，Transwell小室检测细胞侵袭能力；Western印迹检测细胞增殖蛋白ki67、侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）及信号转导与转录因子3（STA33）和磷酸化的STAT3的蛋白表达。结果乳腺癌组织中Sixl的mRNA及蛋白表达均显著高于癌旁组织（P〈0．05）；转染Sixl的siRNA组细胞Sixl的蛋白表达显著低于空白对照组（P〈0．05）；与空白对照组比较，Sixl-siRNA组细胞活力及侵袭能力均显著低于空白对照组，ki67、MMP-2、MMP-9和p-STAT3蛋白表达均显著低于空白对照组（P〈0．05），3组间STAT3的蛋白表达无显著性差异（P〉0．05）。结论乳腺癌组织中Sixl高表达．抑制其表达可通过下调STAT3信号降低细胞的活力及侵袭能力。