SjGPR89蛋白对日本血吸虫生长发育的影响

目的初步探索日本血吸虫G蛋白偶联受体89(SjGPR89)在日本血吸虫生长发育中的作用。方法利用SMART网站和TMHMM网站预测其SjGPR89蛋白的蛋白结构和跨膜结构。取40只SPF级6~8周龄雌性昆明小鼠经腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴(200±10)条/鼠,分别于感染后第14、16、18、20、22、24、26、28、30天解剖小鼠,收集虫体,提取虫体RNA并逆转录为cDNA,采用qRT-PCR检测SjGPR89 mRNA在血吸虫中的相对转录水平。取12只SPF级6~8周龄雌性昆明小鼠,经腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴(60±2)条/鼠,随机平均分为SjGPR89干扰组(干扰组)和对照组,干扰组于感染后第1、6、10、14、18、22、26天经尾静脉注射SjGPR89双链RNA(dsRNA)10μg/鼠,对照组注射等量绿荧光蛋白(GFP)dsRNA。小鼠感染后第30天收集虫体,取雌、雄虫各5条,提取虫体RNA,逆转录为cDNA,采用qRT-PCR检测虫体SjGPR89 mRNA相对转录水平;用多聚甲醛乙酸乙醇(AFA)固定分开的雌、雄虫后,采用Image J软件测量虫长,并统计虫荷;采用卡红染色对雌、雄虫的性腺进行染色,荧光显微镜下观察生殖腺发育状态的变化。另取12只SPF级6~8周龄雌性昆明小鼠,经腹部贴片法感染尾蚴(40±2)条/鼠,随机平均分为干扰组和对照组,干扰组于小鼠感染后第26、30、34、38天经尾静脉注射10μg dsRNA/鼠,于第42天解剖小鼠,取肝组织,qRT-PCR检测肝组织中胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA的相对转录水平;肝组织经5%NaOH消化后,计数每克肝组织虫卵数;制备肝切片,Masson染色后镜下观察肝纤维化程度。结果TMHMM网站预测结果显示,SjGPR89为一种较保守的9次跨膜的G蛋白偶联受体;SMART网站预测结果显示,SjGPR89蛋白由4个跨膜区域、1个高尔基pH调节受体(GPHR)结构域、1个低复杂度区域和一个脱落酸(ABA)G蛋白偶联受体(GPCR)结构域组成。qRT-PCR检测结果显示,小鼠体内不同发育时期(14~30 d)日本血吸虫的SjGPR89 m RNA相对转录水平较平稳,仅雌虫在感染小鼠后的第26~28天有大幅上升。感染后第30天,qRT-PCR检测结果显示,干扰组雌、雄血吸虫中SjGPR89的mRNA相对转录水平分别为307.70±58.21、97.88±11.38,较对照组的767.10±142.79、182.02±7.42(t=5.96、12.39,均P<0.01)敲低了59.89%和46.23%;干扰组雌、雄虫的虫长分别为(12.13±2.67)、(10.00±1.72)mm,较对照组的(13.67±1.74)、(11.48±1.94)mm(t=4.10、5.09,均P<0.01)减短了11.22%和12.93%;干扰组雌、雄虫的虫荷数分别为(23.00±1.83)、(23.75±2.99)条,较对照组的(26.75±0.96)、(31.00±3.56)条(t=3.64、3.12,均P<0.05)减少了14.02%和23.39%。卡红染色结果显示,干扰组雌虫的性腺发育出现延滞状态,卵巢和卵黄腺着色较浅,且卵巢的面积远小于对照组;雄虫的性腺发育不充分,形态大小较对照组小。干扰组的每克肝组织虫卵数为(2777.33±197.94)个,较对照组的(5871.32±875.25)个(t=5.97,P<0.01)减少了52.70%。感染后第42天,Masson染色观察结果显示,干扰组小鼠肝胶原纤维面积小于对照组;qRT-PCR检测结果显示,干扰组小鼠肝组织中的胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、α-SMA mRNA相对转录水平分别为530.20±246.81、825.26±139.82、551.59±189.94,均低于对照组(t=3.81、2.50、4.72,均P<0.05)。结论干扰SjGPR89蛋白可抑制日本血吸虫的生长发育、生存能力和雌虫产卵,减轻对宿主肝脏的病理损伤。