siRNA干扰对人软骨细胞Skp2表达的影响

目的:研究表达载体介导的siRNA对Skp2在人软骨细胞中表达的抑制效果。方法:利用在线siRNA设计工具设计3条Skp2序列siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504作为靶位点,采用基因重组技术体外成功构建Skp2 siRNA表达载体,检测重组质粒转染对Skp2 mRNA表达的影响,并采用DNA电泳对其结果进行验证。结果:测序表明Skp2干扰序列正确,siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504转染组的Skp2 mRNA表达明显低于空载组和NC组(P<0.05),Skp2 mRNA在siRNA-59、siRNA-318、siRNA-504中的抑制率分别为60%、41%、64%,且以siRNA-504转染组抑制率最高。结论:成功构建Skp2干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人软骨细胞Skp2 mRNA表达,可为骨关节炎治疗提供有力证据。

Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响

目的构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SPC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响。方法根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆入pGenSil-1质粒中,构建Skp2 pshRNA重组质粒。脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞。RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达。MTT检测各组细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变。结果重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功。转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05)。结论构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖。

靶向Skp2基因siRNA对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的:设计和构建Skp2特异性的siRNA真核表达载体,观察Skp2siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生物学特性的影响.方法:人工合成Skp2基因干扰序列并定向插入到RNAi真核表达载体pRNAT-U6.1/Neo,通过测序鉴定.用脂质体介导的基因转染方法转入HCT116细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞系,半定量RT-PCR方法检测靶基因的表达.流式细胞技术分析细胞周期分布,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果:测序表明Skp2干扰序列完全正确.RT-PCR结果显示2条Skp2siRNA真核表达质粒均能有效抑制核干细胞因子mRNA的转录表达(P<0.05).MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降(29.21%±1.40%,30.10%±1.50%vs49.05%±4.50%,53.03%±4.92%,均P<0.05).流式细胞术检测结果显示转染后G0/G1期细胞数占生长周期细胞数的比例增多,即表现为G1期阻滞,S期细胞的比例降低.结论:成功构建了Skp2干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞Skp2mRNA表达,细胞增殖能力减弱,为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据.

Skp2基因的研究进展

Skp2被称为S期激酶相关蛋白,属于F-box蛋白家族成员,在蛋白泛素化降解过程中可作为SCF-Skp2复合物的重要成分起识别底物蛋白的作用,主要通过降解细胞周期调节蛋白介导细胞周期调控和细胞增殖。为更全面地了解Skp2的研究进展及开展其在动物科学与医学领域的研究,从Skp2基因的结构、功能、与人类肿瘤致病机理、转录调控和启动子方面的关系进行了综述。

Skp2过表达载体的构建及表达

目的:在HEK293细胞中获得Skp2全长基因,构建其高效真核表达载体。方法:提取人HEK293细胞总RNA,反转录合成c DNA,以特异性引物扩增Skp2全长基因并克隆入p Babe载体,筛选阳性克隆进行序列测定后,鉴定其表达情况。结果:PCR扩增得到特异性的约1300 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致;将构建的p Babe-Skp2质粒转入HEK293细胞,与空质粒对照相比,Skp2的m RNA和蛋白表达水平均提高,并且p27蛋白水平降低。结论:构建获得Skp2基因高效真核表达载体,将用于Skp2的功能研究。

Skp2-p27^(kip1)与恶性肿瘤关系的研究进展

Skp2-p27kip1通路在调控细胞周期由G1~S期中具有十分重要的作用。本文综述了近五年来对Skp2与p27kip1基因的结构与功能,二者编码的蛋白在组织中表达的关系,Skp2基因所编码蛋白的生物学特征以及其与肿瘤分级、分期、预后、治疗之间的关系等方面的研究,并展望了其应用前景。

大肠腺癌中p27^(kip1)、skp2和p53基因的表达及意义

目的:检测大肠腺癌组织中p27kip1、skp2、p53基因的表达情况,并分析与临床病理参数之间的关系,探讨其与大肠癌发生、发展的关系。方法:应用RT-PCR技术检测60例大肠腺癌、20例正常大肠粘膜组织中p27kip1、skp2、p53mRNA的表达水平,免疫组化SP法检测60例大肠腺癌、20例大肠腺瘤、20例正常大肠粘膜组织中p27kip1、skp2、p53蛋白的表达情况。结果:大肠腺癌组织中p27kip1、skp2、p53mRNA的表达水平分别为0.540±0.155,0.597±0.125,0.302±0.127均与正常大肠粘膜组织有差异(P<0.01)。60例腺癌中p27kip1、skp2、p53的阳性表达与它们在腺瘤和正常粘膜组织中的阳性表达有显著差异(P<0.001)。p53的表达与大肠癌浸润、淋巴转移及Dukes’分期有相关性(P<0.05);p27kip1和skp2的表达与肿瘤细胞分化程度、肿瘤组织浸润深度、Dukes’分期的进展及淋巴结转移有相关性(P<0.05)。p27kip1表达与skp2表达呈负相关(r=-0.714,P<0.001),p53表达与p27kip1表达呈负相关(r=-0.653,P<0.001),而与skp2表达呈正相关(r=0.617,P<0.001)。结论:在大肠癌恶变进程中,p27kip1、skp2和p53表达发生相应变化,它们均可能参与了大肠癌发生、发展的过程,3种基因的联合检测可为临床判断大肠腺癌的恶性生物学行为提供重要参考。

Skp2和p27在乳腺癌分子亚型中的表达及与基底样型乳腺癌的关系

目的探讨Skp2和p27在乳腺癌分子亚型中的表达及与基底样型乳腺癌的相关性。方法 1 452例乳腺癌标本制作组织芯片,免疫组化MaxVision快捷法检测ER、PR、HER2、CK5/6和EGFR,按照Nielsen标准进行分子分型。同时检测Skp2和p27。结果在乳腺癌基底样型、HER2过表达、裸表达型、腺腔A型、腺腔B型中,Skp2表达率为63.3%、51.9%、53.1%、21.3%和13.7%;p27表达率为35.2%、46.3%、41.4%、55.9%和63.0%。Skp2在基底样型、HER2过表达型和裸表达型的表达中显著高于腺腔A和B型(P<0.01);而p27在基底样型、HER2过表达型和裸表达型中的表达率显著低于腺腔A和B型(P<0.05)。Skp2和p27的表达水平与ER表达相关(P<0.01)。Skp2和p27的表达在基底样型乳腺癌中呈负相关(P<0.01)。结论 Skp2的高表达及p27的失表达可能与ER阴性乳腺癌的发生和发展有关,并且Skp2在基底样型乳腺癌的发生、发展中起重要作用。在基底样型乳腺癌中二者基因相关性的研究为其发病机制的阐明提供帮助。

Skp2在人类及妇科肿瘤中作用的研究进展

肿瘤是一种细胞周期调控异常性疾病。细胞S期激酶相关蛋白2（Skp2）是一种与肿瘤的发生发展密切相关的细胞因子。是F-box蛋白家族成员之一；Skp2是泛素连接酶复合物的底物识别蛋白，通过泛素蛋白酶体途径降解p27、p21、p130等多种细胞周期调节因子，在多数恶性肿瘤中表达增高。Skp2基因被认为是一种原癌基因，具有癌基因功能，在人类肿瘤的发生、发展和生物学特性及转归中发挥着不可忽视的作用，具有潜在的诊断和治疗价值。该文总结了Skp2在人类及妇科肿瘤发生发展机制中的调控作用及其基因治疗现状的研究进展。

鸡Skp2实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了建立以及应用鸡细胞S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)的实时荧光定量PCR方法,以鸡Skp2基因为研究对象,根据GenBank中已发表的鸡Skp2和β-actin序列的高度保守区域设计引物,构建重组质粒作为标准品,成功建立了检测鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)中Skp2 mRNA表达的实时荧光定量RT-PCR方法,并对其Tm值和引物浓度等进行了优化。该方法最优反应体系为20.0μL,包含Real-time PCRMaster mix(2×)10.0μL,上、下游引物(10.0μmol/L)各1.0μL,cDNA 2.0μL,ddH2O 6.0μL;最佳反应条件为95℃预变性10 s,95℃变性5 s,60℃退火/延伸34 s,30个循环。应用该方法对CEF中Skp2 mRNA的表达量进行检测,发现在CEF感染禽网状内皮组织增生病病毒(REV)后,其细胞中Skp2 mRNA表达量均高于对照组,且在24、48、72 h显著增加。研究首次建立了检测鸡Skp2基因的检测方法,该方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步定量研究鸡Skp2 mRNA表达及其与细胞周期的关系奠定了基础。

消岩汤抑制WISP2/CCN5基因敲减的MCF-7细胞增殖的分子机制

目的观察消岩汤对WISP2/CCN5基因敲减的MCF-7细胞增殖的抑制作用,以及WISP2/CCN5、Skp2和p27Kip1 mRNA和蛋白水平变化,探索消岩汤抑制WISP2/CCN5基因敲降的MCF-7细胞增殖的分子机制。方法WISP2/CCN5 shRNA慢病毒质粒转染MCF-7细胞,构建WISP2/CCN5基因敲减的MCF-7细胞系,采用高、中、低浓度的消岩汤孵育WISP2/CCN5基因敲减的MCF-7细胞24、36及48 h后,检测细胞增殖抑制率、WISP2/CCN5、Skp2及p27Kip1的mRNA和蛋白水平。结果WISP2/CCN5基因敲减的MCF-7细胞增殖抑制率低于空白组和空载组(P<0.05),消岩汤干预组细胞增殖抑制率高于WISP2/CCN5基因敲减组(P<0.05);高浓度消岩汤孵育WISP2/CCN5基因敲减的MCF-7细胞48 h组细胞增殖抑制率高于相同浓度孵育24 h组(P<0.05)。WISP2/CCN5基因敲减组Skp2 mRNA和蛋白水平均高于空白组和空载组(P<0.05,P<0.05),而p27Kip1 mRNA和蛋白水平则低于空白组和空载组(P<0.05,P<0.05)。消岩汤干预组的Skp2 mRNA和蛋白水平低于WISP2/CCN5基因敲减组(P<0.05,P<0.05),而p27Kip1 mRNA和蛋白水平则高于WISP2/CCN5基因敲减组(P<0.05,P<0.05)。结论消岩汤干预WISP2/CCN5基因敲减的MCF-7细胞,在mRNA和蛋白水平下调Skp2表达,上调p27Kip1表达,抑制MCF-7细胞增殖;2.高浓度消岩汤对细胞增殖活性的抑制较显著,孵育时间较长组对细胞增殖活性的抑制较显著。

荧光定量PCR技术检测喉鳞状细胞癌标本中Skp2基因表达

目的:探讨细胞S相激酶相关蛋白(Skp2)基因在喉鳞状细胞癌发生、发展中的作用。方法:应用荧光定量逆转录PCR(FQ-PCR)技术检测40例喉鳞状细胞癌及10例癌旁正常组织中Skp2 mRNA拷贝数,并分析其与临床相关因素的关系。结果:40例喉鳞状细胞癌Skp2 mRNA中位拷贝数为6 622.54 copy/μg RNA,10例癌旁正常组织为0 copy/μg RNA,两组差异有统计学意义(P<0.01);喉鳞状细胞癌和癌旁正常组织Skp2 mRNA阳性表达率分别为50%和0,差异有统计学意义(P<0.01)。喉鳞状细胞癌中颈淋巴结转移组Skp2 mRNA中位拷贝数为617 138.4 copy/μg RNA,颈淋巴结无转移组为0 copy/μg RNA,两组差异有统计学意义(P<0.05);喉鳞状细胞癌中颈淋巴结转移组和颈淋巴结无转移组Skp2 mRNA阳性表达率分别为100.00%和35.48%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:Skp2基因可能与喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移有关,FQ-PCR为一精确检测喉鳞状细胞癌Skp2 mRNA表达的方法,Skp2 mRNA表达水平可能成为预测喉鳞状细胞癌颈淋巴结转移的更加灵敏的指标。

RNA干扰Skp2基因抑制T47D乳腺癌细胞生长

目的构建S期激酶相关蛋白2（skp2）RNA干扰真核细胞表达载体，研究skp2基因沉默对乳腺癌T47D细胞生长的抑制作用。方法应用Ambion公司在因特网上的设计程序设计小干扰RNA。构建3个不同的重组体转染T47D细胞，RT-PCR和Western Blotting检测skp2基因表达，细胞计数分析Skp2RNA干扰对肿瘤细胞增殖的影响。结果重组体经PCR和测序证实准确连接。转染重组体的细胞skp2的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降。重组体转染的细胞增殖明显降低。结论用RNA干扰下调skp2表达抑制乳腺癌细胞生长，skp2可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。

Skp2 siRNA表达载体构建及其对喉鳞状细胞癌细胞Skp2基因表达的抑制作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对Skp2的siRNA表达载体,抑制喉鳞状细胞癌细胞Skp2基因的表达。方法:根据设计siRNA的原则,针对人Skp2的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到真核表达载体pGPU6/Neo中构建重组体pGPU6Skp2,转化DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后,进行序列测定。然后转染重组质粒至Hep2细胞中,应用流式细胞术检测Skp2基因的表达。结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列。pGPU6Skp2转染细胞后,Skp2基因在蛋白水平的表达量受到明显抑制。结论:成功构建了针对人Skp2的siRNA表达载体,通过转染Hep2细胞,可有效抑制细胞Skp2的表达,为后续基因治疗研究奠定了实验基础。

p27^(KIP1)和SKp2蛋白异常表达与人胶质瘤临床病理学关系的研究

目的探讨脑胶质瘤组织中p27^(KIP1)蛋白和S期激酶相关蛋白2(skp2)异常表达与临床病理因素的关系。方法应用免疫组化SP法检测45例胶质瘤和10例正常脑组织中p27^(KIP1)和Skp2蛋白表达情况。结果p27^(KIP1)和Skp2蛋白在正常脑组织和胶质瘤组织中的阳性表达率差异有显著性(P=0.033、P=0.005);p27^(KIP1)和Skp2蛋白表达水平与胶质瘤组织学分级相关(P<0.01),但与患者的性别、年龄及肿瘤大小无明显关系(P>0.05);Skp2阳性表达组和阴性表达组之间p27^(KIP1)蛋白阳性率差异有显著性(x^2=4.8458,P=0.028);胶质瘤组织中p27^(KIP1)蛋白和Skp2蛋白的表达呈负相关(r=-0.5477,P<0.05)。结论Skp2蛋白在胶质瘤组织中表达上调,加速了对p27^(KIP1)泛素化依赖的蛋白降解,使p27^(KIP1)蛋白表达降低,失去对细胞周期的调控并促进细胞异常增殖,从而参与了胶质瘤的发生和发展。

Skp2和P27在食管鳞状细胞癌中表达及其临床意义

目的:研究S期激酶相关蛋白2(Skp2)与细胞周期素抑制因子P27在人食管鳞状细胞癌中蛋白水平的表达差异,分析二基因的相互关系及其与食管鳞癌浸润深度、组织学分级、淋巴结转移等临床病理因素间的关系,探讨Skp2和P27在食管鳞癌发生发展过程中的作用及其临床意义。方法:应用免疫组化检测49例食管鳞癌及其切缘正常组织中Skp2和P27的表达,用PearsonX2检验分析二者的表达在两组间是否有差别;用Pearson X2检验和Fisher's确切概率法分析Skp2和P27表达与食管鳞癌患者性别、年龄、临床分期、病理组织学分级、淋巴结转移等临床病理因素间的关系;用Pearson相关系数分析食管鳞癌中Skp2和P27两者表达的相关性;结果:Skp2在食管鳞癌及其切缘正常粘膜组织中的阳性表达率分别为57.1%和20.0%,(P<0.05)。P27在食管鳞癌及其切缘正常粘膜组织中的阳性表达率分别为51.0%和85.0%,(P<0.05)。Skp2和P27的表达与临床分期、组织学分级、淋巴结转移显著相关,与患者性别、年龄无显著相关,且二者在食管鳞癌中表达呈显著负相关。结论:食管鳞癌中Skp2基因在蛋白水平高表达,在切缘正常粘膜组织中低表达,P27蛋白表达与Skp2蛋白表达之间呈负相关。Skp2和P27表达与食管鳞癌肿瘤临床分期、组织学分级、淋巴结转移等临床病理因素密切相关。

Skp2基因表达下调对HepG2细胞生物学特性及SP1和p27蛋白表达的影响

目的研究Skp2基因表达下调对HepG2细胞生物学特性及p27和SP1蛋白表达的影响。方法构建Skp2基因干扰慢病毒质粒,包装后感染HepG2细胞,48 h后,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;侵袭小室试验检测细胞侵袭能力;Western blot检测Skp2基因下调后p27和SP1蛋白的表达情况。结果与正常HepG2细胞组相比,Skp2干扰慢病毒组细胞Skp2蛋白的表达明显下调,p27蛋白表达大幅增加,细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡率增加近两倍,G0/G1期细胞增多;SP1蛋白表达减少,浸润、迁移的细胞数减少约50%(P<0.05)。结论 Skp2蛋白表达下调抑制了HepG2细胞的增殖,促进HepG2细胞的凋亡,造成细胞侵袭能力减弱。Skp2蛋白表达下调导致p27蛋白表达上调、SP1蛋白表达下调,在上述生物学特性变化中可能发挥了重要作用,为深入探讨肝癌的病理机制奠定了基础。

S期激酶相关蛋白2与p27和第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因在卵巢上皮性肿瘤中的表达与其发生发展的关系

目的探讨卵巢上皮性肿瘤中S期激酶相关蛋白2(Skp2)和第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)基因表达与其发生发展的关系。方法用免疫组织化学法检测卵巢良性肿瘤(30例)、卵巢交界性肿瘤(30例)及卵巢癌(50例)中Skp2、p27和PTEN蛋白的表达。结果 Skp2在卵巢癌中的表达(48.00%)明显高于良性肿瘤(0.00%)和交界性肿瘤(0.00%),差异有统计学意义(P<0.01);p27蛋白与PTEN蛋白在卵巢良性肿瘤(分别为90.00%、93.33%)和交界性肿瘤中(70.00%、70.00%)的表达明显高于卵巢癌(22.00%、40.00%),差异有统计学意义(P<0.01)。Skp2、p27和PTEN蛋白表达与卵巢癌的病理类型无关(P>0.05);卵巢癌中Skp2和p27的表达呈负相关(r=-0.637,P<0.01);Skp2和PTEN蛋白表达呈负相关(r=-0.726,P<0.01);p27和PTEN蛋白表达呈正相关(r=0.719,P<0.01)。结论 Skp2高表达、p27和PTEN蛋白低表达可能在卵巢上皮性肿瘤的发生发展中发挥重要作用,联合检测上述3种基因有助于判断卵巢癌的恶性程度和预后。