大鼠Slfn3基因重组腺病毒载体的构建和包装

目的:构建携带大鼠Slfn3基因的重组腺病毒表达载体,转染HEK293细胞产生病毒。方法:以p MSV-Slfn3-GFP为模板扩增Slfn3基因,再以质粒p Adeno-EF1a-MCS-MCMV-EGFP-3FLAG为载体,通过酶切、连接及转化获得p Adeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG重组腺病毒载体,采用内切酶Nhe I酶切及测序鉴定重组腺病毒载体,将该重组载体在HEK293细胞进行包装和放大培养,镜下观察荧光、Western blot鉴定重组质粒标签Flag蛋白在HEK293细胞中的表达。结果:构建重组腺病毒质粒p Adeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG,并在HEK293细胞中成功包装和扩增,经鉴定获得重组腺病毒r AD-Slfn3。结论:成功构建重组腺病毒载体p AdenoEF1-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG,并在HEK293细胞成功获得重组腺病毒r AD-Slfn3。

小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定

目的构建小鼠短发夹RNA(shRNA)-Schlafen3(Slfn3)重组腺病毒载体,并检测其在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法采用GenBank基因软件查询小鼠Slfn3基因序列,设计并合成3个siRNA片段及其引物,取腺病毒干扰载体pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP,采用限制性内切酶进行酶切,线性化后连接siRNA片段,获得重组腺病毒载体shRNA-Slfn3,从中筛选阳性克隆抽提质粒,进行DNA测序验证;取对数生长期的人胚胎肾细胞HEK293,采用Admax系统将目的质粒转染至HEK293细胞,获得重组腺病毒shRNA-Slfn3后进行小量扩增及病毒滴度测定;取小鼠脾脏单个核细胞体外培养至对数期EPCs,用前述所得重组腺病毒shRNA-Slfn3对其进行转染48 h,采用绿色荧光蛋白量检测重组腺病毒的转染效率。结果测序验证3组目的质粒构建成功;获得shRNA-Slfn3重组腺病毒,病毒滴度分别为2.37×10^(13)pfu/L、3.16×10^(13)pfu/L及4.74×10^(13)pfu/L;EPCs转染效率为(63.64±2.58)%。结论成功构建了小鼠shRNA-Slfn3重组腺病毒载体,转染小鼠脾源EPCs后的转染效率较高。