猪传染性胃肠炎病毒M、sM基因重组杆状病毒的构建及病毒样颗粒的组装

利用RT-PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）M和sM结构蛋白基因，将其分别克隆人载体pFastBac^TM Dual，获得转移质粒pFastBac^TM Dual-M和pFastBac^TM Dual-M-sM，将重组质粒转化至DHl0Bac感受态细胞，经抗性与蓝白斑筛选，获得杆状病毒重组质粒Bacmid-M和Bacmid-M-sM，在Cellfection作用下，将杆状病毒重组质粒转染昆虫细胞sf9，获得重组杆状病毒rBac-M和rBac-M-sM。通过WesternBlot、间接免疫荧光试验（IFA）进行检测，结果显示：重组蛋白在杆状病毒感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达。将重组杆状病毒rBac-M和rBae-M-sM分别感染sf9昆虫细胞，进行TGEV病毒样颗粒（VLPs）的体外组装试验。结果表明，M蛋白在sf9细胞内单独表达，M蛋白和sM在sf9细胞内共同表达，都可形成TGEV病毒样颗粒，而且病毒粒子大小不等，直径在61～101nm。试验结果为进一步研究TGEV结构蛋白在病毒装配过程中的作用提供了理论依据。

猪传染性胃肠炎病毒sM基因反义逆转录病毒的包装和鉴定

将编码猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)sM基因的cDNA反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,质脂体法将重组质粒plxas-sM转染PA317细胞,经抗生素G418(500μg/mL)筛选出稳定的产毒细胞克隆.分别扩大培养细胞克隆,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的重组病毒滴度,最高达1.50×105CFU/mL.提取重组病毒的RNA进行RT-PCR分析,结果表明成功获得plxas-sM逆转录病毒.

鸡传染性支气管炎病毒分离株sM基因扩增

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由冠状病毒科冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的急性、高度传染性疾病。本研究通过PCR检测方法将IBV肾型分离株进行了sM基因的扩增,通过对IBV病毒sM株的前期研究,制作出sM株的扩增引物,并通过PCR技术进行扩增,得到了纯化的条带,结果扩增出了目标大小的323bp的目的片段,证明得到了目的基因sM基因,表明该PCR检测方法能实现临床鸡传染性支气管炎的检测,得到了有较好的临床应用价值。

TGEV的sM、M和N基因克隆及特征分析

参照GenBank中收录的TGEVsM、M和N基因序列各设计1对特异引物,经RTPCR扩增获得了TS株的相应基因片段,分别约为346、932和1217bp,其大小与预计的目的片段相符。与其他毒株的相应基因相比较,并经剪接后,TS株的sM、M和N基因全长分别为248、789和1149bp,各编码82个、262个和382个氨基酸;TS株与Purdue株、TFI株和961933株的sM基因核苷酸序列同源性分别为95.2%、92.7%和90.2%;推导氨基酸的同源性分别为95.9%、97.2%、98.8%;与Purdue株、TFI株、TGEVH株和961933株的M基因核苷酸序列同源性分别为95.2%、98.0%、99.6%和95.0%;推导氨基酸的同源性分别为97.0%、97.3%、98.5%、93.5%;与Purdue株、TFI株、FS722/70株、Korea株、TO14株、TGEVH株和961933株的N基因核苷酸序列同源性分别为98.1%、97.7%、99.0%、98.3%、99.2%、99.0%和95.9%,推导氨基酸的同源性分别为97.9%、98.4%、99.0%、97.7%、99.5%、96.2%、96.6%。并对TS株基因间的保守序列和sM、M和N基因及其编码的相应氨基酸的结构特征进行了分析,发现sM和N基因在TGEV中保守;并提示在我国不仅存在有2个不同亚基因型的TGEV,而且我国的TGEV可能是输入性的。

番茄灰叶斑病抗病基因Sm分子标记的建立

以抗病纯合体(Sm/Sm)、抗病杂合体(Sm/sm)和感病纯合体(sm/sm)番茄为试验材料,以提取的基因组DNA为模板,根据与抗病基因Sm紧密连锁的RFLP标记设计特异引物进行PCR扩增,对扩增产物进行序列分析寻找酶切位点,采用限制性内切酶酶切的方法,创建新的与番茄灰叶斑病抗病基因Sm紧密连锁的CAPS标记,以期为今后番茄抗病育种工作提供技术支撑。结果表明:创建的T050标记稳定、可靠,是一个共显性分子标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。

与番茄灰叶斑病抗病基因Sm连锁的CAPS标记开发

利用与番茄灰叶斑病Sm基因连锁的RFLP标记,设计开发了一个CAPS标记,用于抗番茄灰叶斑病育种。以已知抗病基因型的番茄种质为材料,参照与Sm基因紧密连锁的RFLP标记设计特异引物,进行PCR扩增,产物克隆测序分析寻找特异性酶切位点,开发了一个与抗病基因Sm紧密连锁的CAPS标记,命名为T280。利用特异引物T280进行PCR扩增,供试材料均扩增出1条655 bp的特异条带。经限制性内切酶Mme I酶切后,抗病纯合材料仍保留1条655 bp的特异条带,感病纯合材料产生206 bp和449 bp的特异条带,抗病杂合材料产生206 bp、449 bp和655 bp的特异条带。利用不同遗传背景的番茄材料对该标记进行验证,结果发现,能够区分抗病杂合、抗病纯合和感病纯合材料。开发的CAPS标记稳定可靠,是一个比较理想的共显性CAPS标记,可用于Sm基因的分子标记辅助育种。

子宫平滑肌细胞SM22-α基因的pEGFP-C3载体构建及siRNA筛选

为研究SM22-α基因在子宫平滑肌中作用机制提供实验基础,通过筛查siRNA有效序列,来构建含SM22-α基因的pEGFP-C3-SM22-α载体.首先构建含有SM22-α基因的pEGFP-C3载体;其次利用FT293细胞并采用Western-bolt检测SM22-α蛋白表达的改变,筛查到siRNA有效序列;得到含SM22-α基因pEGFP-C3-SM22-α载体和干扰SM22-α表达蛋白的siRNA有效片段,成功干扰SM22-α蛋白在子宫平滑肌中的表达.

一株猪流行性腹泻病毒的分离培养及其ORF3、sM和N基因的序列分析

研究旨在克隆猪流行性腹泻病毒(PEDV)HuN-HY1902毒株N、sM、ORF3基因并进行序列分析,为PEDV的临床防控提供依据。采用Vero细胞进行病毒分离培养,免疫过氧化酶单层细胞染色法进行病毒鉴定;RT-PCR扩增PEDV HuN1902毒株N、S、sM、ORF3基因,经纯化后进行序列测定,利用DNAStar、Mega等生物信息学软件进行序列分析。RT-PCR扩增得到PEDV ORF3、N、sM片段大小依次为744 bp、1400 bp、和1100 bp。该毒株ORF3基因核苷酸序列与PEDV/USA/Missouri130/2015毒株相似性最高,为99.7%;sM基因核苷酸序列与CH/SCMY/2018和BJ-2011-1相似性最高毒株,为96.3%;N基因核苷酸序列与CH/SCMY/2018毒株相似性最高,为98.6%;ORF3、N和sM基因核苷酸序列与疫苗毒株CV777依次为96%、95.1%和93.9%。进化分析显示,该毒株的ORF3、sM和N基因的核苷酸序列与2018年流行毒株CH/SCMY/2018处于同一分支,而与经典毒株CV777、SM98的亲缘关系较远。所分离培养的毒株命名为PEDV HuN-HY1902毒株,为新流行的变异毒株。

转木霉菌激发子基因的链霉工程菌株构建及检测

里氏木霉菌Trichoderma reesei QM 6a蛋白激发子基因xyn2及绿木霉菌蛋白激发子基因sm1通过调节植物乙烯、茉莉酸等信号途径激发其诱导抗性,提高其免疫力。本研究根据天蓝色链霉菌偏爱密码子人工合成了这两个基因,将其单价连接到链霉菌表达载体pIB139中。通过酶切鉴定的阳性质粒pIB139-xyn2(sm1)转化入ET12567(pUZ8002)中间菌株,利用接合转移技术定点整合到利迪链霉菌A01基因组中,采用PCR技术鉴定工程菌株A01-xyn2(sm1)。随后构建A01-xyn2+sm1双价链霉菌工程菌株并验证。实验结果表明:利用接合转移技术已成功获得含xyn2,sm1,xyn2+sm1的链霉菌工程菌株,将实现抗生与诱抗的协同作用,提高防治植物病害的效果。

马凡综合征患者胸主动脉夹层发病机制研究进展

马凡综合征(MFS)是一种常染色体遗传性结缔组织疾病,可以发生胸主动脉夹层等严重的心血管系统病变,发生胸主动脉夹层后需行胸主动脉人工血管置换术,但围手术期病死率高,深入研究MFS患者胸主动脉夹层发病机制具有重要意义。MFS患者发生胸主动脉夹层与原纤维蛋白-1(FBN1)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、转化生长因子β受体2(TGFBR2)基因突变及整合素α9(ITGA9)、肌动蛋白结合蛋白(SM22α)基因低表达和转化生长因子β(TGF-β)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)信号转导通路调节异常有关。FBN1基因突变是MFS(1型)患者发生胸主动脉夹层主要的机制之一,当FBN1基因突变时,蛋白质结构异常导致微纤维功能障碍,无法维持胸主动脉壁中膜弹力蛋白的稳定,胸主动脉血管壁中膜的弹性纤维断裂,胸主动脉壁中膜回弹能力下降,在受到异常的血流冲击后,出现局部血管管腔持续膨出,形成胸主动脉瘤,当胸主动脉内膜出现撕裂口,血液从撕裂口处流入内膜和中膜之间,形成胸主动脉夹层。TGFBR1和TGFBR2是TGF-β的信息传递分子,该基因突变诱导血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡,数量减少,促进MFS发生胸主动脉夹层。ITGA9基因低表达,诱导VSMC从收缩表型转化为合成表型,胶原纤维降解,导致细胞与细胞之间的黏附能力下降,也导致细胞与胞外基质之间的黏附能为下降,胸主动脉壁中膜无法抵抗异常血流的切应力。SM22α基因是一种VSMC表型标志基因,其甲基化修饰导致低表达,诱导VSMC发生表型转化,参与细胞外基质重塑,血管壁中膜弹性下降,促进胸主动脉壁中膜退行性病变。TGF-β、AngⅡ信号转导通路参与VSMC的增殖、分化、调亡生理功能的调节,也参与血管性疾病的发生;在小鼠胚胎期阻断此信号转导通路,可以引起小鼠主动脉壁中膜层弹力纤维合成受损,最终形成胸主动脉瘤/胸主动脉夹层。

内皮素-1与CGRP对血管平滑肌细胞表型转化及增殖的影响及机制

目的探讨血管平滑肌细胞内皮素(ET-1)及CGRP对血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化及增殖的影响及其机制。方法用MTT法测定ET-1及ET-1与CGRP联合应用对VSMC增殖的影响,运用3H-TdR法检测其对DNA合成的影响,运用流式细胞仪法检测对增殖周期的作用,实时定量观察对VSMC表型变化及SM22α、骨架蛋白表达量的影响。结果与对照组比较,ET-1能促进VSMC的增殖;增加VSMC DNA合成;促使VSMC从G0期向S期的转变,使G0/G1期细胞百分比降低,S期细胞百分比增加;使VSMC发生表型转化,而在这个过程中SM22α及骨架蛋白表达量明显降低。加入CGRP后可逆转ET-1的上述作用,使VSMC的增殖及DNA合成均被抑制,且G0/G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比明显降低。另外,亦可抑制VSMC向合成型转变,增加SM22α、骨架蛋白表达量。结论 ET-1不仅能促进VSMC的增殖,还可使VSMC向合成型表型转化;而CGRP可逆转ET-1的作用,抑制增殖及表型转化;ET-1与CGRP的上述作用可能与两者调节SM22α、骨架蛋白的表达有关。

SM22α基因与肿瘤的关系研究进展

SM22α是一种重要的细胞骨架相关蛋白，近年来发现它在细胞转化、分裂、黏附、转移中都发挥了重要作用。研究表明它在乳腺癌、大肠癌、前列腺癌以及非小细胞肺癌等肿瘤中表达均下调甚至消失。由此推测，SM22α是一种新的肿瘤抑制因子，对它的进一步研究将有助于肿瘤的早期诊断。