Tat-SmacN7诱导肿瘤细胞辐射敏感性的机理研究

探讨Tat-SmacN7诱导食管癌细胞株EC109和非小细胞肺癌细胞株NCL-H460辐射敏感性的机制。采用体外培养EC109细胞和NCL-H460细胞,实验分为对照组、单纯给药组、单纯照射组和给药联合照射组,用RT-PCR检测CAPS8、CASP9和CASP3的转录水平,Fluorogenic caspase assay试剂盒检测Caspase-3、-8、和-9的活性,ELISA方法检测Caspase活性。结果显示,两种肿瘤细胞在使用Tat-SmacN7联合Caspase的抑制剂z-VAD-fmk后,存活曲线较不使用抑制剂组均有明显上移;Caspase-3、-8、和-9的活性在Tat-SmacN7组明显提高,提示Tat-SmacN7可通过细胞凋亡线粒体途径发挥辐射增敏作用,有望成为一种新的辐射增敏剂。

SmacN7诱导乳腺癌细胞MDA-MB-157凋亡的作用及其机制

目的:探讨SmacN7对乳腺癌细胞MDA-MB-157凋亡的作用及机制。方法:将0-20μmol/L的Smac N7应用于乳腺癌细胞MDA-MB-157,用MTS法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,hoechst33342染色观察细胞核型变化,JC-1染色检测线粒体膜电位,LDH释放实验检测药物细胞毒性,qPCR检测各基因转录水平,并通过抑瘤实验证实该药抑制乳腺癌增殖的作用。结果:应用Smac N7后,乳腺癌细胞MDA-MB-157增殖抑制率和细胞凋亡率均增加(P<0.01),核型发生显著变化,细胞线粒体膜电位降低,LDH释放量增加,并上调TRAIL、DR4、DR5、p53、PARP-1、Bax、Bid、BAK、caspase-3、caspase-8、caspase-9基因的转录水平(P<0.01),下调Ras、PI3K、AKT、mTOR、Bcl2、Bcl-xL、MCL-1、Survivin、cIAP-1、cIAP-2基因的转录水平(P <0.01)。结论:SmacN7可通过TRAIL介导的死亡受体途径和线粒体介导的内源性凋亡途径诱导乳腺癌细胞MDA-MB-157凋亡,发挥抗乳腺癌的作用。

Tat—SmacN7对人乳腺癌细胞系的放射增敏作用

目的观察Tat—SmacN7对人乳腺癌SK—BR-3细胞放射敏感性的影响并探讨其机制。方法取对数生长期乳腺癌SK—BR-3细胞，分为对照组、叮射线照射组、Tat—SmacN7组和Tat—SmacN7联合1射线照射组（联合组）。MTT法检测Tat—SmacN7对SK—BR-3细胞的毒性；克隆形成实验检测Tat—SmacN7的存活分数；单击多靶模型拟合细胞存活曲线并计算放射增敏比（SER）；流式细胞术检测Tat—SmacN7联合1射线照射对细胞凋亡的影响；Westernblot法检测细胞凋亡抑制蛋白XIAP和cIAP-1蛋白表达水平。结果Tat—SmacN7随浓度升高对SK-BR-3细胞的增殖抑制率增大，药物浓度与细胞增殖率呈正相关（r=0．924，P〈0．05），IC50为（62．62±1．19）μmol／L，IC20为（5．66±0．67）μmol／L；5μmol／LTat—SmacN7能增加SK—BR-3细胞的放射敏感性，联合组与照射组放射增敏比为1．48；6Gy．y射线照射后48h，联合组凋亡率显著高于照射组（t=7．01，P〈0．05）；与对照组相比，Tat—SmacN7组XIAP表达水平降低，联合组XIAP和cIAP-1蛋白表达水平均降低。结论Tat—SmacN7通过促进人乳腺癌细胞SK—BR-3细胞的凋亡，增加其辐射敏感性，这一特性与XIAP的表达有关。

ANTP-SmacN7对肿瘤细胞的辐射增敏作用及其机制

目的 探讨ANTP-SmacN7融合蛋白对肿瘤细胞的辐射增敏作用及其机制。方法 合成ANTP-SmacN7融合蛋白并观察其细胞渗透能力，Western blot法检测辐射对XIAP表达量的影响，克隆形成实验观察ANTP-SmacN7融合蛋白的辐射增敏作用。Annexin V-FITC/PI双染法测定药物及射线对肿瘤细胞凋亡的影响，Western blot法检测ANTP-SmacN7阻断XIAP前后Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的变化。结果 ANTP-SmacN7融合蛋白可以进入细胞内，并在细胞内蓄积；辐射诱导肿瘤细胞体外XIAP表达量与肿瘤辐射敏感性呈负相关（r=0.82）；ANTP-SmacN7对肿瘤细胞有辐射增敏作用，增敏比为1.41；ANTP-SmacN7融合蛋白可促进4、8和10 Gy γ射线诱导的XIAP高表达肿瘤细胞的凋亡（t=-14.924、-7.294和-15.866，P〈0.05）。辐射可诱导Caspase-3表达水平的升高，ANTP-SmacN7对Caspase-3蛋白表达水平不产生影响，但可增加活化Caspase-3的裂解片段的数量。结论 ANTP-SmacN7融合蛋白可通过诱导Caspase-3的活化降低肿瘤细胞的辐射抗性。

类Smac小分子SmacN7对人胰腺癌细胞株SW1990凋亡影响的观察

目的:观察外源性类Smac小分子SmacN7对人胰腺癌细胞株SW1990凋亡的影响,以期找到治疗胰腺癌的新方法。方法:使用固相多肽合成技术(SPPS)和反相高效液相层析法(RP-HPLC)制备SmacN7;Heochst 33342染色法观察SW1990分别与PBS液和500ng/mL TRAIL、500μg/mL SmacN7作用24h的细胞凋亡形态;流式细胞术(FCM)检测SW1990分别与500μg/mL SmacN7和500ng/mL TRAIL作用24h的细胞凋亡率(CAR)并观察细胞周期分布;四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测SW1990分别与50、100、200和500μg/mL SmacN7作用24、48和72h的细胞生长抑制率(CGIR);MTT法检测500μg/mL SmacN7分别与200、500、1 000和2 500ng/mL TRAIL或10、20、40和60μmol/L吉西他滨(GEM)联用,与SW1990作用24h的CGIR。结果:SmacN7纯度≥95%,相对分子质量3 278.08,质谱鉴定结果与预期结果完全一致。SW1990与500μg/mL SmacN7作用24h和与500ng/mL TRAIL作用24h细胞形态变化类似,细胞体积和细胞核增大,轻度肿胀,细胞变为短梭形,细胞核呈亮蓝色,分叶或碎片状,边缘集中,且数目更多;细胞周期均显示G0/G1期阻滞,S期比例下降,细胞生长变缓;CAR分别为5.64%和15.30%。SW1990分别与50、100、200和500μg/mL SmacN7作用24、48和72h,CGIR不同,且随SmacN7浓度增加和作用时间延长,CGIR升高,P<0.05;500μg/mL SmacN7分别联合200、500、1 000和2 500ng/mL TRAIL,与SW1990作用24h,SW1990的CGIR为18.11%、37.67%、42.63%和67.60%;分别联合10、20、40和60μmol/L GEM与SW1990作用24h,SW1990的CGIR分别为17.65%、31.85%、40.11%和74.99%。两组均随TRAIL和GEM浓度的增加,SW1990的CGIR升高。结论:SmacN7能促使SW1990凋亡,且有浓度和作用时间依赖性。其作用机制与XIAP表达量降低,细胞色素C和Caspase-3活性裂解片段p17表达量升高有关。SmacN7有可能成为治疗胰腺癌的新方法。

拟线粒体促凋亡多肽N7在人卵巢癌细胞对顺铂增敏作用中的研究

目的:探讨拟线粒体促凋亡多肽N7(SmacN7)能否增加人卵巢癌细胞对顺铂的敏感性及其与Caspase-3表达的关系。方法:通过细胞增殖抑制率测定及平板克隆形成试验研究顺铂单独应用组(A组),50μg/L SmacN7+顺铂组(B组)、100μg/L SmacN7+顺铂组(C组)及200μg/L SmacN7+顺铂组(D组)的细胞增殖抑制率和细胞克隆形成率;采用细胞免疫化学法检测上述分组中Caspase-3的表达。结果:单独应用顺铂时,24、48、72 h的增殖抑制率分别为(6.12±1.16)%、(13.47±1.15)%及(28.91±1.08)%。SmacN7(50～200μg/L)联合顺铂应用时,随着SmacN7浓度的增加或作用时间的延长,细胞增殖抑制率明显增加,药物作用24、48、72 h后增殖抑制率分别为(9.34±1.78)%～(49.81±2.11)%、(25.24±2.11)%～(65.54±2.27)%、(44.45±1.21)%～(82.36±2.19)%。肿瘤细胞存活率明显降低,分别为(25.13±0.52)%、(21.17±0.55)%、(18.23±0.54)%和(15.27±0.56)%。SmacN7联合顺铂应用后,Caspase-3的表达比单独应用顺铂明显增加(P=0.000)。结论:SmacN7能够明显增加人卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。